示差走査蛍光光度を用いたタンパク質 - リガンド相互作用の定量

この手順の全体的な目標は、タンパク質リガンド相互作用の解離定数を推定することです。これは、まず、異なる濃度のリガンドを持つタンパク質の混合物を指示薬色素と共に調製することによって達成されます。2番目のステップは、インジケーターの蛍光を記録しながらこれらのサンプルを加熱して、タンパク質のアンフォールディングを監視することです。

次に、タンパク質のアンフォールディング曲線を一連の融解温度に変換します。最後のステップは、これらのデータを適切なモデルに当てはめて、解離定数を推定することです。最終的に、示差走査型蛍光測定は、タンパク質とそのリガンドとの相互作用をよりよく理解するために使用されます。

この手法は、等温法、滴定法、熱量測定法、表面プラズマ共鳴法などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、ほとんどの機関ですでに利用可能な装置で、中程度の量のサンプルのみを使用して数時間以内に完了できることです。この方法は、タンパク質に対するリガンドの親和性や相互作用の相対的な強度など、タンパク質化学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。一般に、この方法に不慣れな人は、使用するサンプルの選択とデータの分析の両方が難しいため、苦労するでしょう。

この手順を開始する前に、次の解決策を準備してください。この表に詳述されている試薬と、利用可能な最高濃度での対象リガンドのストック、およびこの濃度の6倍の10倍希釈を含む混合物。以前のデータからおおよその解離定数がわかっている場合は、kdの上下に少なくとも2つの濃度を準備します。

ここにテーブルの例を示します。混合物の18マイクロリットルを8つのウェルのそれぞれに分注します。A-Q-P-C-Rプレートでは、残りの7つのウェルのそれぞれに最初のウェルに2マイクロリットルの溶媒を加え、リガンド希釈シリーズの各メンバーに2マイクロリットルを追加します。

A-Q-P-C-Rシールをプレートにかぶせて、プレートの良好なシールを実現します。プレートの中央にハンドアプリケーターを置き、シールを片側に滑らかにしてから、プレートの残りの半分で繰り返します。プレートをGの500倍で2分間遠心分離し、気泡を取り除きます。

次に、プレートをステップ1のQPCR装置にセットします。岩石フィルターの溶融曲線オプションを選択し、高速ランプ速度を選択します。装置の実行の終了時に熱変性を実行します。

画面上の分析ボタンをクリックします。結果ファイルを保存します。タンパク質サーマルシフトソフトウェアを開きます。

[プロパティ]タブで新しいスタディを作成し、名前を付け、[条件]タブでリガンドを詳しく説明します。実験ファイルタブに移動し、保存した結果ファイルをインポートします。

それぞれの内容を設定します。さて、分析タブに移動し、分析ボタンを押して結果を分析します。溶媒の存在下でのタンパク質だけで、この図に示すような結果が得られることを確認してください。

次に、再現の痛みの結果で観察された融解温度を調べます。これにより、配位子濃度の増加に伴って融解温度が明らかに上昇することを確認します。これらのデータは、添付の論文で説明されているように、解離定数の近似値を提供するために使用されます。

これらの溶液は、解離定数を決定する手順に必要です、この表に詳述されているマスターミックスと15の異なる濃度でのリガンドのストック、これは10倍に希釈されます。最後の実験で。理想的には、推定kdの上下に少なくとも2桁のリガンド濃度を含め、推定kdを中心として濃度を算出します。

希釈系列の例を以下に示します。推定 KD の 1 桁以内にある 7 つの点に注目し、その両側にさらに 4 つの点を配置します。選択肢がある場合は、飽和している値により多くのポイントを含めます。

U底の96ウェルプレートの8つのウェルのそれぞれに120マイクロリットルのマスターミックスを加えて、マスターミックスの便利な分注のためのリザーバーとして機能します。次に、8チャンネルピペットを使用して、18マイクロリットルのマスターミックスをPCRプレートの1カラムに分注します。さらに5列を繰り返して、プレート上に合計48個のウェルが6×8のパターンで充填されます。

次に、20マイクロリットルの配位子茎または溶媒を8つのウェルのそれぞれに加えます。別のU底96ウェルプレートでは、8チャンネルピペットを使用して、8つの異なるリガンドストックまたは溶媒の2マイクロリットルを吸引し、これらをマスターミックスで満たされたPCRプレートの1カラムに加えます。同じ8つのリガンドまたは溶媒ストックで繰り返します。

さらに 2 つのカラムについては、残りの 8 つのリガンドまたは溶媒ストックのうち 2 マイクロリットルを吸引し、これらをプレートの 4 番目のカラムに加えます。これをさらに 2 つの列で繰り返します。これにより、16種類のリガンドおよび溶媒サンプルすべてについて3倍のサンプルが得られます。

A-Q-P-C-Rシールをプレートに貼ります。プレートをGの500倍で2分間遠心分離します。プレートをQPCR装置にセットし、装置実行の終了時に前に指定したパラメータを使用して熱変性を実行します。

画面上の分析ボタンをクリックします。結果ファイルを保存します。タンパク質サーマルシフトソフトウェアを開きます。

プロパティタブで新しいスタディを作成し、これに名前を付け、条件タブでリガンドを詳しく説明します。実験ファイルタブに移動し、保存した結果ファイルをインポートし、それぞれの内容を設定します。

さて、分析タブに移動し、分析ボタンを押します。画面の左側にあるメニューから「replicates」タブを選択して、結果を表示します。三重として。

トリプリケートの厳密さに基づいてデータの信頼性を評価します。トリプリケートが再現性が低い場合。生データを詳しく調べます。

boltman法と微分法の両方を使用してデータを解析します。融解温度を評価するには、反復結果タブを選択し、反復結果プロットで、プロットをtm、ボルツマン、TM導関数の間でボタンで切り替えます。サンプルの再現性が高い方法を選択してください。

複数の遷移を示すサンプルの場合、ほとんどの場合、多重融解モードで微分法を使用するのが最適です。エクスポートタブを使用して、Excelでさらに調査するために結果をエクスポートします。この分析は、リガンド濃度と融解温度のテーブルをExcelで作成することから始めます。

GraphPadプリズムソフトウェアを開き、XYテーブルを作成します。リガンド濃度のX列と融解温度の結果のY列を使用してデータを入力します。[分析]タブで、[非線形回帰曲線フィット]オプションを選択します。

正しいモデルを入力するには、新規選択と新規計算式の作成を行います。適切な方程式を単一部位のリガンド結合として挿入します。「初期値のルール」ボックスを選択し、初期値のルールを入力します。

パラメータ P を定数として制約し、タンパク質の最終濃度を入力します。解析を実行するには解析を選択し、データを協調モデルに適合させるため、またはデータを曲線に適合させるには追加解析を選択します。融解温度のバイナリシフトの表示は、付属のプロトコルテキストに記載されています。

この方法は、ヘキソキナーゼとグルコースとの相互作用を測定するために使用されました。初期画面では、KDは0.2〜1.7ミリモルである可能性が高いと示唆されています。より大きな画面の結果は、KDが1.2プラスマイナス0.1ミリモルの単一の結合イベントのモデルに良好に適合していることを示していますが、推定されるHETO SQUA LトランスフェラーゼWCBMは、GTPへの結合に強い熱シフトを示しています。

最初のスクリーニングでは、KDは200〜500マイクロモルと示唆されました。詳細な実験では、見かけのKDが120プラスマイナス20マイクロモルであることが示唆されています。しかし、X軸に対数スケールを使用すると、モデルと協調モデルによる同じデータのデータ分析との間に有意な不一致があり、データへの優れた適合が示され、WCBMがGTPAへの結合において反協力的であることを示唆し、推定GDP60でかなり異常な結果が観察されます。 oxy Beta D mano, Heur two oh, ACE WCBI.

リガンドがなく、リガンド濃度が高いと、単純な単相融解パターンが観察されます。しかし、配位子濃度が中程度の場合、2つの異なる融解ピークが観察されます。2 セットのピーク間の遷移は、二相融解をモデル化する全濃度にわたって用量依存

リガンドの割合の合計として、遊離リガンドと高リガンドの結果は、データによく適合します。この適合度は、高リガンド濃度で観察された結果をフル占有率に外挿することで改善されます。リガンドに結合したWCBIの割合について得られたデータは、単純な結合モデルに優れた適合を示しています。

58±2マイクロモルのKDで 一度習得すると、この手順に従って適切に実行されれば、繰り返しを含めて4〜5時間でこのテクニックを行うことができます。チップトップ静脈蛍光や等温滴定型熱量測定などの他の方法を実行して、温度依存性やSTA形状などの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、示差走査型インフルエンザを使用して相互作用の解離定数の推定値を決定する方法について十分に理解できるはずです。