マルチモーダル光学顕微鏡法カリビアン·リーフビルサンゴにポリープの組織形態と構造を明らかに

次の実験の全体的な目標は、厚さ1〜2ミリメートルのサンゴポリープを3Dで画像化して、微細構造、サンゴの色素とその局在を理解することです。これは、まずサンプルをワックスに埋め込み、次にミクロトームを使用してサンプルを1ミクロンのセクションに切断することで達成されます。次に、カスタム設計のシリアルブロックフェイス技術を使用して、サンゴのポリープを画像化し、3D画像を再構築します。

複数の2D画像を使用して、サンゴ組織の構造的完全性を損なうことなく、サンゴ組織の微細な構造詳細を解像する技術の能力を示す結果が得られます。手順のデモンストレーション。今日は、私の研究グループの共同研究者であるMaunde Siva博士の第一人者です。

プレフィルトレーションワックスを調製するには、ホットプレート上のガラスビーカーでフレークに3.6グラムのステアを溶かします。次に、400ミリグラムのスーダンを追加します。ワックスバックグラウンド蛍光を最小限に抑えるために、よく混合し、赤い半透明の溶液が得られるまで待ちます。

次に、81グラムのパラフィンを加えてよく混ぜます。続いて、15グラムの白い粒状のVIバーを追加し、同じビーカーで完全に溶かします。溶かしたら、再度混ぜて完全に混合したワックス溶液を得ます。

次に、混合物をガラス瓶に加え、蓋でゆるく閉じます。ガラス瓶を摂氏60度の対流式オーブンに入れて、材料を液体状態に保ち、すべての浸透が行われるようにします。この溶液は200ミリリットルにすることができ、2つの100ミリリットルボトルに分割することができます。

1つは浸透用、もう1つはカリブ海のサンゴ礁形成サンゴのサンプルをAUから収集し、野外でパラホルムアルデヒドに固定しました。SBFI用のサンゴ組織を埋め込むには、まず野外で採取したサンゴポリープを洗浄し、パラホルムアルデヒドで摂氏4度で保存します。その後、画像化する準備ができたら、PB S3で毎回5分間洗浄します。

ポリープをex Cal 2溶液で24時間、またはポリープに炭酸カルシウムが全くなくなるまで脱灰します。いくつかの脱灰サンゴポリープを、25、50、75、および100%エタノールシリーズの1つのブロックとしてインキュベートし、その後に1つのxキシレンをインキュベートします。各セッションで30分間代用して、サンプルを脱水します。

次に、加工したポリープを100%キシレンに入れます。摂氏65度のオーブンで30分間代用します。その後、新鮮な溶液と交換し、さらに30分間インキュベートします。

上部を下に向けて、表面をできるだけ平らにしてポリープを向けます。2対1、1対1、1対2の解決策を作成します。キシレン代替品およびプレろ過ワックス。

50ミリリットルのファルコンチューブで、これらの3つの増加する濃度のプレフィルトレーションワックスでサンゴポリープをインキュベートし、続いて100%プレフィルトレーションワックスで毎回30分から1時間インキュベーションします。次に、サンプルを埋め込みワックスに移します。30分後に埋め込みワックスを取り外し、次に新しい埋め込みワックスと交換し、摂氏65度で最低4時間インキュベーションを続けます。

その後、ブロックを撮影します。これは、ワックスに埋め込まれると、埋め込まれた赤いワックスが不透明であるため、サンプルの位置が見えなくなるために必要です。次に、予熱した新しいステンレス鋼の埋め込み型の周りに高融点ワックスの小さな滴を置き、冷まします。

2番目のアリコートから少量の溶かしたばかりの寝具用ワックスを注ぎ、白いワックスドットの上に下向きのサンゴポリープをすばやく配置します。次に、プラスチック製のサンプルホルダーをステンレス製のトレイに置き、ワックスがプラスチック金型の表面に来るように、さらに埋め込みワックスを注ぎます。次に、セットアップ全体を摂氏65度のオーブンから取り出し、ワックスが完全に固まるまでベンチまたは涼しい表面で冷まします。

その後、乾燥させたブロックを摂氏4度の冷蔵庫に入れ、光から保護して長期保存し、ブロックを切断します。まず、トリミングして1ミクロンの切片を切り取ります。ミクロトームを使用して、サンプルを含む滑らかなブロック面の画像をキャプチャします。

いつも。切片を取り除くと、白いワックスが消え始めるとサンプルが表示されます。次に、適性のある蛍光フィルターを使用してモノクロカメラで画像をキャプチャーし、各サンプルから3〜4個の脱灰コアである発色団またはサンゴポリープ画像の自家蛍光をピックアップします。

2光子蛍光イメージングを行うには、洗浄したサンゴポリープのコアを4%パラホルムアルデヒドに逆さまに、780ナノメートルの2光子レーザーを使用して、10倍対物レンズを使用して2つの異なる倍率で3〜4ポリープの画像画像を使用して、覆われたガラス底皿に逆さまに置きます。次に、タイルスキャンモードを使用して、XYの焦点面ごとに約25〜100枚の画像を10ミクロンまたは20ミクロン間隔で収集します。次に、10ミクロンまたは20ミクロンの間隔でZ軸を介して50〜100枚の画像を収集します。これは、サンゴポリープごとに合計で約5,000〜10,000枚の画像になります。

その画像の後に、コアとサンゴの種を表す3〜4つのポリープ領域。次に、すべての画像を生データ形式でシステムのハードディスクに保存します。この手順では、正方形のトリミングツールを使用して 1 つのポリープに焦点を絞って 2D データをトリミングしてファイル サイズを縮小し、1 つの TIF ファイルとしてコンパイルします。

取得ソフトウェアで。SBFIデータのアセンブルファイル、またはボリュームアルゴリズムプロジェクトのEMERISサーパスプログラムモジュールで2つの光子光学セクションのタイル化された複数のZスタックを開き、SBFIデータを3Dでレンダリングします。シャドウ投影を使用して、ボクセルがしきい値である ISOSURFACE モードを作成し、ソリッド サーフェス パターンを作成します。

XY xzおよびYZ直交モードでクリッピングプレーンアルゴリズムを使用して3D投影を視覚化し、サンゴの3D構造と形状を明らかにします。次に、キーフレームアニメーションモジュールを使用してプロジェクションをアニメーション化します。同じerrisプログラムで、5%の圧縮率でビデオファイルを生成し、ボリューム3Dおよび等値面モダリティを使用してVI形式でムービークリップを生成します。

これは、M Anis と M fa Lata のサンゴポリープの 2 つの光子蛍光 3D 画像です。これらの2つの画像は、450〜700ナノメートルで収集された光信号で2つの光子レーザーの780ナノメートル励起を使用して、成分のスペクトル分離なしでキャプチャされ、これらの2つの画像は同じ励起で収集されましたが、2つの光マルチプライドメインチューブ検出器を同時に使用して2つのコンポーネントからデータを収集しました。 1つは500〜550ナノメートル、もう1つは650〜720ナノメートルです。これらは深度コーティングされた画像です。

赤は 2D で最も浅いコンポーネントで、青は最も深いコンポーネントです。はい。この手順を試行する際には、赤いワックスに埋め込まれたサンプルを適切に準備することを覚えておくことが重要です。シリアルブロックフェイスイメージングと2フィートオン蛍光顕微鏡の組み合わせにより、さまざまなレンズスケールでサンゴの色素沈着と細胞構造の分析が可能になります。

このビデオを見た後、サンゴ礁形成サンゴとそのスペクトル特性を3次元で扱い、画像化する方法を十分に理解しているはずです。