プラークアッセイを通じてウイルス濃度の測定：伝統と新しいオーバーレイシステムの使用

この手順の全体的な目的は、細胞培養における個々のプラーク数を数えることで、感染性ウイルス粒子を定量し、ウイルス濃度を決定することです。まず、感染させるための細胞を播種し、コンフルエントな単層を形成させます。次に、定量する未知のウイルスサンプルの段階希釈を行います。続いて、この段階希釈したウイルスストックを用いてコンフルエントな単層に感染させ、その後に固定用オーバーレイを適用します。最終ステップでは、対象となるウイルスの適切な培養時間経過後、プラークを固定および染色し、個々のプラーク数をカウントします。最終的に、プラークアッセイはさまざまな方法で活用および改変でき、未知のウイルスサンプルのウイルス力価を決定するために使用されます。

半凝固オーバーレイ法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、ハイスループットおよび従来型の応用のどちらにおいても、適用と除去がはるかに簡便であることです。さらに、試薬の加熱も不要です。96ウェル形式で液体オーバーレイを使用することで、新規治療化合物の迅速なスクリーニングが可能になるため、本手法の意義は多くの異なる溶菌性ウイルスの研究へと広がります。これにより、従来のプラークアッセイの実施に費やされていた長時間の研究室作業を大幅に削減できます。

アッセイの前日に、感染当日に90～100%のコンフルエンシーに達するように、対象のウイルスに適した細胞を播種します。また、ストック溶液もアッセイの前日に調製することが可能です。まず、36%ホルムアルデヒドストック溶液5.56 millilitersと蒸留水14.44 millilitersを混合し、蒸留水による10%ホルムアルデヒド固定液を調製します。次に、20%エタノール中の1%クリスタルバイオレットを蒸留水で希釈し、クリスタルバイオレット染色液を調製します。続いて、無菌条件下で、使用する細胞の種類に適した2xプラーク培地を調製します。試薬に非滅菌のものがある場合は、0.2 micronフィルターでろ過してください。プラークアッセイに使用するリキッドオーバーレイを調製するには、スターラーで急速に撹拌している蒸留水97.6 milliliters入りのフラスコに、Avicel 2.4 gramsを加えます。スターラーで撹拌できなくなるまで、室温で溶液を混合します。その後、フラスコをシェーカーに移し、均一にホモジナイズさせるために30分間激しく振盪します。最後に、121 degrees Celsius、14 PSIで30分間オートクレーブ滅菌します。

プログラムが終了したら、密閉して室温で保存します。アガロースオーバーレイ用には、蒸留水で0.6%アガロースストック溶液を調製し、スターラーバーで混ぜてからオートクレーブで溶解させます。カルボキシメチルセルロースオーバーレイ用には、蒸留水で2%カルボキシメチルセルロース溶液を調製し、混合します。その後、前述と同様にオートクレーブ処理を行います。

播種翌日に、アッセイを開始する前に倒立顕微鏡を用いて細胞のコンフルエンシーと生存率を確認します。細胞が標準的な細胞形態を示し、コンフルエンシーが約90%であることを確認してください。

細胞増殖培地を用いて、感染サンプルの10倍段階希釈を行います。希釈回数は、対象となるウイルスの予想タイターに基づいて調整してください。また、細胞の生存能を独立して確認し、プラークの同定を容易にするため、非感染コントロールサンプルを準備します。単層を乱さないよう注意しながら、非感染コントロールおよび段階希釈したサンプルをプレートのウェルにピペッティングします。

単層細胞へのウイルスの接触を最大化するため、液量を可能な限り低く抑えつつ、細胞全体を覆うのに十分な量の接種液を使用します。プレートを組織培養インキュベーターに入れ、45分から1時間、細胞を感染させます。20分ごとにプレートを静かに揺らし、均一に液が行き渡るようにし、細胞単層の乾燥を防ぎます。

感染の間に、液体オーバーレイ用のオーバーレイ作業溶液を調製します。温めたプラーク培地と、室温の1.2〜2.4% Stock Avicelを1:1の比率で混合し、0.6〜1.2% Avicelオーバーレイ培地の作業溶液を得ます。アガロースまたはCMCオーバーレイの場合は、温めたプラーク培地と、加熱した0.6%アガロースまたは2% CMCのストック溶液を1:1の比率で混合します。その後、温度を平衡化させるため、56 °Cのウォーターバスに30分間置きます。細胞死やウイルスタイターの低下を防ぐため、溶液が熱すぎず、温かい程度の状態であることを確認してください。感染後、感染させた単層細胞にオーバーレイを適用します。オーバーレイを追加した後、分析するウイルスに応じて、37 °C、5% carbon dioxideの条件下で2〜14日間、プレートをインキュベートします。

液体オーバーレイを用いて細胞を固定する場合、Avicelオーバーレイを傾けて捨てるか吸引し、10% ホルムアルデヒド溶液をウェルにピペッティングして、室温で30分から一晩固定します。アガロースまたはCMCの場合は、オーバーレイに直接ホルムアルデヒド溶液を加え、室温で1時間から一晩放置します。固定後、ホルムアルデヒドを廃棄し、アガロースの半固体プラグをスパチュラで手動で除去します。

染色前に、Avicelセルプラークを水ですすぎ、残留しているオーバーレイ固定液を除去します。

染色を行うには、最小限の量のクリスタルバイオレット溶液で細胞を覆い、約15分間静置します。必要に応じてプレートを揺らし、均一に溶液が行き渡るようにしてください。その後、水でクリスタルバイオレット染色液を静かに洗い流します。固定、染色、乾燥が完了したら、将来の解析のためにプラークを無期限に保存できます。各ウェルのプラーク数を数え、プラーク数が5個未満または100個を超えるウェルは除外してください。同じ希釈倍率のテクニカルレプリケートがある場合は、その平均値を算出します。プラークのサイズと形態を記録してください。ある希釈段階におけるプラーク数の平均値と全希釈倍率の逆数を掛け合わせ、ストックサンプルのウイルス力価を決定します。

この画像は、12ウェルプレートを用いたリフトバレー熱ウイルス（RVFV）のプラークオーバーレイの比較を示しています。Vero細胞を12ウェルプレートに2.5 × 10⁵ cellsで播種し、同じ連続希釈されたMP 12の開始サンプルを用いて200 µLで感染させました。感染後、オーバーレイを直接比較するため、0.3%アガロース、0.6%Avicel、または1%CMCのオーバーレイを1.5 mLずつ適用しました。このヒストグラムは、これら3種類のオーバーレイにおけるプラーク数およびタイター測定の結果を示しています。ここでは、12ウェルプレートを用いたVEEVのプラークオーバーレイの比較を示します。Vero細胞は前述と同様に播種し、同じ連続希釈されたVEEV-TC 83ワクチン株の開始サンプルを用いて200 µLの容量で感染させました。感染後、前述と同様に0.3%アガロース、0.6%Avicel、または1%CMCのオーバーレイを1.5 mL適用しました。

ここでも、ヒストグラムは3種類すべてのオーバーレイにおけるプラーク数およびタイター決定の結果を示しています。この画像は、ハイスループットなプラーク・オーバーレイの例です。1ウェルあたり3 × 10⁴個のVero細胞を播種した96ウェルプレートに、同様に段階希釈したリフトバレー熱ウイルスMP 12の開始サンプルを用い、50 µLの接種液を加えて4連で1時間感染させました。オーバーレイについては、ハイスループットな形式で液体オーバーレイを利用することの実現可能性と再現性を判断するため、最終濃度0.6%および1.2%のAvicelを試行しました。このヒストグラムは、各オーバーレイから決定されたタイターを示しています。

この手順を試みる際は、ウイルスによって特性が異なるため、細胞株の変更、培養時間の調整、あるいは増殖培地の最適化などの調整が必要になる場合があることに留意することが重要です。このビデオを視聴することで、液体および半固形オーバーレイを用いた基本的なプラークアッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。