膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングでエシェリヒア·コリ

この手順の全体的な目標は、構造解析および機能解析のためにSIA大腸菌で発現する膜タンパク質を同定することです。まず、細菌を採取し、嘘をついてSDSページで分析し、Ingel蛍光によって正しく折りたたまれたGFPタンパク質を可視化します。第2のステップでは、目的の膜タンパク質を発現することが決定された大腸菌の産生がスケールアップされ、タンパク質発現の誘導に続いて細胞から全膜画分が調製されます。

最後に、全膜画分を4つの異なる界面活性剤に可溶化し、界面活性剤の単分散性を溶解します。可溶化します。GFPタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって分析されます。最終的には、タンパク質を蛍光とプロットされたelucianプロファイルによってモニターし、サンプル中の凝集モノ分散と遊離GFPを評価できます。

構造的および機能的研究のための組換え膜タンパク質の作製は、溶解度が低く、界面活性剤に抽出されると不安定性を継承するため、技術的に依然として困難です。経験上、異なる種由来のオルソログなど、膜タンパク質の複数の変異体をスクリーニングすることで、膜タンパク質の発現成功率を向上させることができることがわかっています。緑色蛍光タンパク質への融合は、真正なフォールディングを報告するために使用されます。

膜タンパク質および大腸菌の発現スクリーニングのためのGFPベースのプロトコルの最初のステップは、全細胞からの界面活性剤溶解物のインゲル蛍光を使用して、スクリーニング内の発現レベルに基づいてさらなる分析のための膜タンパク質構築物を特定し、膜タンパク質および異なる界面活性剤を選択する挙動を、サイズ排除クロマトグラフィーと組み合わせた蛍光検出を使用して評価します。これにより、界面活性剤タンパク質複合体のモノ分散性に関する情報が得られます。IPTG誘発性細菌発現を分析するには、一晩培養24ディープウェルブロックから96ディープウェルブロックに1ミリリットルのIPTG処理eコリン複製を移し、ブロックをシールし、次いで室温でGの6,000倍で細胞を10分間スピンダウンすることから始まる。

その後、ブロックを反転させてメディアをデカントし、ペーパータオルを軽くたたいて残りの液体を排出します。プレートを再度密封し、少なくとも20分後に細胞を摂氏マイナス80度で保存します。ペレットを室温で20分間解凍し、マルチチャンネルピペットを使用して細胞を200マイクロリットルの溶解バッファーに再懸濁します。

細胞を20マイクロリットルのDLPI溶液で処理し、1000RPMおよび摂氏4度で10分間振とうした。次に、25マイクロリットルの10%ドーダマルチサイドを各ウェルに加え、振とうしながらさらに60分間細胞をインキュベートします。DDM処理遠心分離機の後、ディープウェルは、透明化したライセートの10マイクロリットルをブロックし、マイクロタイタープレートに移し、10マイクロリットルのSDSページゲルローディングバッファーを追加します。

次に、ウェルあたり10マイクロリットルの溶解液緩衝液をゲルにロードし、ダイヤフラムが底に達するときに100〜120ボルトの定電圧でゲルを冷蔵室で2〜2.5時間泳動します。ゲルをブルーライトフィルター付きのイメージャーに置き、融合タンパク質を検出して細胞培養をスケールアップします。有能な大腸菌のEloquaを変換した後、コロニーを10ミリリットルのパワーブロスに選択して、摂氏37度で一晩成長させます。

翌朝、5ミリリットルの一晩の培養物を500ミリリットルのパワーブロスに希釈し、250RPMと37°Cで振とうしながら培養を続けます。595ナノメートルでの外径が約0.5になったら、最終濃度1ミリモルまでIPTGを添加して発現を誘導し、培養物を20°Cで一晩シェーカーに戻します。翌朝、遠心分離機で細胞を回収し、ペレットをマイナス80°Cで保存します。

細胞膜を調製する。第3の室温ペレットを細胞ペレット1グラム当たり5ミリリットルのPBSに懸濁し、粘度が水っぽい粘稠度に低下するまで必要に応じて体積を増加させる。次に、塩化マグネシウムを最終濃度のDNA1ミリモルに添加し、最終濃度を1ミリリットルあたり10マイクログラムにし、細胞ペレット1個につき1個のパッケージ済みプロテアーゼ阻害剤錠剤を細胞に添加します。

次に、冷却された細胞の攪乱器を使用して30 KPSIの圧力で細胞を割って開き、次に壊れていない細胞および破片をGの30,000倍および摂氏4度で15分間ペレット化する。すくみ酸を超遠心チューブに移し、Gの200,000倍、摂氏4度で1時間すり下げて全膜画分を回収します。次に、セルホモジナイザーを使用して、メンブレンペレットを10ミリリットルの氷冷PBSに再懸濁し、使用する各界面活性剤のメンブレンを可溶化します。

膜懸濁液の900マイクロリットルを1.5ミリリットルのポリセントリフィチューブに分注します。次に、新たに調製した洗剤100マイクロリットルを適切な1.5ミリリットルのチューブに加え、混合物を摂氏4度で温和な植生とインキュベートします。1時間後、界面活性剤と可溶性画分をベンチトップ超遠心分離機でペレット化し、チューブが少なくとも半分満たされていることを確認し、蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーまたはFEC分析のために仰臥位剤を保持します。

次に、0.3ミリリットル/分の速度で実行中のフローバッファーを備えた、幅広い分画範囲を持つ赤道サイズ排除カラム。次に、100 マイクロリットルの可溶化メンブレンサンプルを同じ流速でカラムに注入し、蛍光光学系を使用してエルシアンプロファイルをモニターします。最後に、elucianの体積と蛍光強度のデータをスプレッドシートプログラムにインポートしてグラフ表示し、残りの可溶化膜材料をインゲル蛍光で分析します。

先に示したように、前記タンパク質ファミリーは細菌の細胞分裂に不可欠です。これらの画像では、24 OUTTA 47の前記コンストラクトのゲル蛍光可視化における代表が示されている。バンドの強度は、表現のレベルを示しています。

例えば、レーンシーン4の融合タンパク質は、両方の株でよく発現しています。しかし、追加の低分子量バンドは、タンパク質が多くのレーンで部分的に分解されていることを示唆しています。GFP単体でサイズに対応したバンドがあります。

例えば、G 4 と H 4 は、C 41 DE 3 P lies S 株では完全に遊離 GFP に分解されます。一方、LEMO 21 DE 3 では、これらのグラフには無傷のタンパク質が含まれています。一次スクリーニングで良好に機能した2つのコンストラクトを、蛍光検出サイズ排除による解析により、4つの界面活性剤のどちらを試験したかによってタンパク質がどのように異なる振る舞いをするかが明らかになりました。

例えば、このタンパク質は、Dool Multisideのリター凝集と対称的なピークのみを示し、その後の精製に最適な界面活性剤となりました。対照的に、他の融合タンパク質は、試験したすべての界面活性剤で同様のプロファイルを示しました。このプロトコルは、例えば、異なる発現条件下で増殖した異なる大腸菌株や、一次スクリーニングと二次スクリーニングの両方での追加の抑止力を含むように容易に拡張できます。

要約すると、このプロトコールの主な目的は、さらなる分析の候補を特定するために、多数の膜タンパク質を発現と界面活性剤化の観点からスクリーニングできるようにすることです。