全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

この手順の全体的な目標は、腸組織から人間の侵入を生成することです。これは、最初に腸粘膜を下にある粘膜下組織から解剖することによって達成されます。2番目のステップは、粘膜をEDTAとインキュベートして、結合組織からの上皮の解離を促進することです。

次に、腸陰窩を解離した上皮から分離します。最後に、腸の陰窩は基底膜マトリックスで培養されます。最終的に、免疫組織化学技術を使用して、培養OIDの上皮組織と特異的な上皮マーカーを示します。

この方法の意味するところは、患者固有の生検からOIDを生成できるようになったため、その組織を研究室で使用して腸の病気や診断を調べることができるようになったということです。緩衝液と試薬を調製した後、テキストプロトコルに従って、基底膜を氷上で解凍し、組織が受け入れられたら、二酸化炭素インキュベーターで24ウェルプレートを摂氏37度で事前にインキュベートします。カルシウムとマグネシウムを含まないKOのPBSまたはDPBSを使用して、DPBSが透明になるまで組織を洗浄します。

粘膜側を上にして、氷冷したDPBSで満たされたシリコンコーティングされたガラスペトリ皿にティッシュを置き、ミニューシンピンで組織を伸ばして固定します。次に、解剖顕微鏡下で、マイクロ解剖ハサミと細い先端の湾曲した鉗子を使用して、粘膜下組織と結合組織から下にある粘膜を切除します。次に、粘膜側を上にして、解剖した粘膜を伸ばして、シリコンコーティングされたガラスペトリ皿に平らに固定します。

湾曲した鉗子を使用して、粘膜の表面をそっとこすります。このステップは、製剤の品質を向上させるために必要です。新たに調製した2ミリモルEDTAキレート化緩衝液で粘膜を覆います。

次に、解剖顕微鏡でテキストプロトコルに従って組織を氷上で3〜4回洗浄した後、湾曲した鉗子を使用して粘膜を優しくこすり落とし、ピペットで腸の陰窩を放出します。陰窩懸濁液をペトリ皿から静かに取り出し、50ミリリットルの円錐管に移します。次に、組織をチェックして、ほとんどすべての陰窩が粘膜から除去されていることを確認します。

陰窩の懸濁液を150マイクロメートルのフィルターで2回ろ過し、顕微鏡を使用して流れを確認します 陰窩の懸濁液を洗浄し、必要な数の陰窩を5ミリリットルの丸底チューブに移した後、テキストプロトコルに従って、150Gと摂氏4度で10分間陰窩画分を遠心分離します。次に、事前に冷却したピペットチップと基底膜マトリックスの再懸濁を使用して上清を取り除きます。クリプトペレット。

ウェルの中央に基底膜マトリックスをゆっくりと排出することにより、ウェルごとにウェルごとに50マイクロリットルの陰窩懸濁液をプレウォームプレートに適用します。プレートを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターで30分間インキュベートし、基底膜マトリックスの完全な重合を可能にします。次に、基底膜マトリックスに500マイクロリットルの完全なヒトミニ腸内培地を重ね、それぞれ2.5マイクロモルのCHIR 9 0 2 2 1を補充します。

そして、Thienは2日後に培地を交換して組織をインキュベートし、その後は1日おきに培養します。この図は、全組織から新たに分離された陰窩の典型的な例を示しています。生検から単離された陰窩の数は、全組織よりも少なくなります。

通常、2回の生検咬は1回のパスで行われます。各生検咬は、生検ごとに平均50〜100のクリップスを持つ10平方ミリメートルの表面をもたらします。5〜6日間培養し、基底膜マトリックスを培養した後、クリップスは小腸用の腸球と結腸用の結腸球を形成するために切り上げられ、7日後に継代されます。

ここに示す生検から確立されたエントリーまたはOIDは、播種時に低密度で同じ発達を遂げます。したがって、パッケージングは通常、培養で10〜12日後に行われます。ここに示すように、OIDとOIDはどちらも管腔側を示し、上皮で裏打ちされています。

増殖細胞はOID内で観察でき、芽の先端内にあります。ここで緑色でe catrinで染色されたOIDの共焦点イメージングは、上皮細胞を示しています。この図は、嚢胞性線維症と上皮細胞接着分子遺伝子の先天性変異による房状腸症の患者から成長しているエントリを示しています。

この手順に従うか、リアルタイムPCRやウェスタン血液などの方法を使用して、関心のある遺伝子または確率に関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、ヒトCripsを一貫して分離して、患者固有の質問に答えるためにラボで効率的にエンターを生成する方法を十分に理解できるはずです。