神経疾患の研究のための生成および使用方法hiPSC派生のNPCへのガイド

この手順の全体的な目標は、神経疾患に寄与する細胞および分子メカニズムを研究するためのプラットフォームとして、ヒト誘導多能性幹細胞または高PSCから神経前駆細胞またはNPCを生成することです。これは、最初にデュアルSMAD阻害剤を使用して高PSCを神経ロゼットに区別することによって達成されます。2番目のステップは、これらのニューラルロゼットを収穫し、それらを拡張可能なN PC集団に成長させることです。

次に、スピン感染を伴うレンチウイルス形質導入。効率を向上させるためのステップは、遺伝子発現を操作するために使用されます。最後のステップは、NPCを懸濁状態で成長させ、自発的にニューロスフェアを形成することです。

最終的に、このプラットフォームは、さまざまな細胞表現型のアッセイに使用できます。たとえば、神経移動に対する遺伝子操作の影響を測定します。ただし、この方法では、移動などの細胞メカニズムに関する洞察を得ることができます。

また、複製、酸化ストレス、アポトーシス、神経突起伸長などの他の生物学的プロセスの研究にも適用できます。ヒト誘発多能性幹細胞または高PSCの分化は、目に見える神経ロゼットの形成をもたらし、これは14日目に神経ロゼットの酵素選択のためのaico基底極性を持つ神経上皮細胞の丸いクラスターとして特徴付けられます。接着した胚体またはebsから培地を吸引し、摂氏37度で1時間インキュベートする6ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットルの神経ロセット選択試薬を添加します。

1時間後。P 1000ピペットマンを使用して、各ウェルから酵素を穏やかに除去し、ウェルごとに1ミリリットルのD-M-E-M-F 12を追加します。ロゼットを洗うには、1ミリリットルのD-M-E-M-F 12を集めてすぐにウェルに戻し、ロゼットをプレートから取り外します。

ロゼットをファルコンチューブピペットに集め、さらに1ミリリットルのD-M-E-M-F 12を注ぎ、すぐに同じウェルに排出して残りのロゼットを取り外します。ロゼット骨材を壊さないように試みたりしないでください。ニューラルロゼットを同じファルコンチューブに集めます。

より多くの酵素を追加することができ、すべての神経ロゼットが収集されたときにロゼットが容易に分離しない場合は、この手順を繰り返すことができます。ファルコンチューブを300Gで3分間回転させます。洗濯を吸引して再燃させます。

ロゼットを2ミリリットルの神経前駆細胞培地に懸濁します。細胞をポリLオルニチンラミネートコーティングされた6枚の壁板に移し、摂氏37度で1週間増殖します。この研究室では、神経前駆細胞またはNPCをマトリゲルプレート上で増殖させ、隔日で供給し、非常に高密度に維持します。

NPCを分割するには、まず培地を吸引し、次に摂氏37度で10〜15分間インキュベートする6ウェルプレートのウェルごとに1ミリリットルの温かいアキュテインを追加します。剥離した細胞を、機械的ストレスをできるだけ少なくして、D-M-E-M-F 12を含む15ミリリットルのチューブに静かに移します。酵素ペレット内で細胞を1000Gで5分間回転させながら細胞をT化しないでください、遠心分離後5分間、上清を吸引し、NPCを再懸濁します。

6ウェルプレートのオリジナルウェルあたり約1ミリリットルのNPC培地では、再懸濁および細胞計数後に、6ウェルプレートのコンフルエントウェルあたり5〜1,000万個の細胞が予想されます。NPCを維持するために、6ウェルプレートのウェルあたり約100万〜200万個の細胞をNPCプレートに再配置します。ニューロスフェア形成の効率は、実験と細胞株の間で異なるが、通常、凝集が起こる場合、6壁の非接着プレートのウェルあたり200,000〜100万個の細胞が着座している場合に最も良く起こる、理想的には分裂から1〜2日以内に着座する細胞の数を減らす。

NP NPCには、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを形質導入して、トランスフェクションされた細胞の割合を増やす必要があります。スピン感染を使用します。各ウェルから培地を吸引し、関連する過剰発現と交換するか、または希釈された所望の感染の多様性に力価を付けたレンチウイルスまたはレトロウイルスを制御します。

NPC培地では、6ウェルのプレート1ウェルあたり1.5ミリリットルを使用し、1000Gおよび室温でプレート遠心分離機で1時間回転させます。スピン後、プレートをインキュベーターに戻し、細胞死を減らします。スピン感染後8時間以内にメディアを交換してください。

この手順は、NPC由来のニューロスフィアをNPC培地で一度洗浄して、細胞の破片を取り除くことから始めます。プレートを45度の角度で傾け、ニューロスフェアが落ち着くのを待ってから、ニューロスフェアを吸引せずにできるだけ多くのメディアを取り除きます。新しいメディアと交換します。

次に、P 200ピペットを使用して顕微鏡下でNPC由来のNEUROSPHERESを手動で選択し、1つのNeuros球をマトリゲルコーティングされた96ウェルプレートの各ウェルに移します。結果のばらつきを減らすために、同様のサイズのニューロスフィアを選択することが重要です。冷たいNPC培地で希釈した0.5ミリグラムのマトリゲルを、各96ウェルプレートのニューロスフェアに加えます。

ピペットチップを使用して、個々の神経球を井戸の中央に手動で中央に配置し、神経球の移動を48時間行います。細胞を固定し、目的の免疫組織化学マーカーで染色した後、Forex顕微鏡対物レンズを使用してニューロスフェア全体を撮影します。ラジアルマイグレーションを測定するには、image Jソフトウェアを使用します。

フリーハンド選択ツールを使用して、最も遠い移動セルのエッジを手動でトレースします。「解析」タブの下にある「測定の設定」ウィンドウで、その領域がチェックされていることを確認してください。次に、測定関数を使用して、結果の形状の面積を計算します。

面積測定値の値と円の面積の方程式を使用して、同様に外半径を決定し、元の神経球のエッジをトレースします。面積を測定し、内半径を計算します。半径方向の移動合計を、外側半径と内側半径の差として計算します。

これらの画像は、高PSCから胚体、神経ロゼット、NPC、およびNPCが発現することが検証されたニューロン、NPCマーカーのネスティング、および神経幹細胞転写因子SOXの2つに対する高PSC神経分化の段階を示しています。ベータ3チューブリン染色は、すべてのNPC集団でも見られます。NPCは、神経幹細胞転写因子PAC6と4ブレイン前駆細胞マーカーも発現します。

TBR 2、ただしLMX one AおよびFOX A 2 NPCのような中脳マーカーは、緑色で示されるβ3つのチューブリン陽性ニューロンおよび赤色で示される20〜30%グリア線維性酸性タンパク質陽性アストロサイトを区別することができる、高品質で高いPSCである。NPCはほとんどの細胞でnestonとSOX 2を発現しますが、低品質のNPCはSOX 2陰性のパッチを持ち、ネガティブ細胞にのみ巣を作ります。高品質のNPCから分化した4週齢のニューロンは、マップ2のABとベータ3の乱流

高力価のレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターによる形質導入が成功した後。80%を超える細胞が蛍光レポーターによって標識されています。ベクトルニューロス球の生成に含まれると、比較的均質なサイズのニューロスフェアの集団が得られ、これは培養中で約1週間健康を保つことができます。

定期的な摂食ニューロスでは、マトリゲルでの移動の48時間の前後のこれらの明視野画像に示されているように、球体移動は健康なニューロスフェアで堅牢に発生しますその開発後。この技術は、統合失調症の分野の研究者がヒト誘発性PLポネント幹細胞由来NPCの神経移動を調査する道を開きました。レトロウイルスとの作業は潜在的に危険であり、すべての組織培養作業はウイルスが存在する可能性のあるBL2プラス条件で行う必要があることを忘れないでください。