共焦点検眼鏡イメージングとマウス緑内障における細胞の形態計測：神経変性中に網膜ミクログリアの活性化のインビボダイナミクス

次の実験の全体的な目標は、網膜のin vivo共焦点イメージングにより、慢性緑内障のマウスモデルにおけるミクログリアダイナミクスを特徴付けることです。これは、網膜と視神経乳頭の蛍光ミクログリアを観察するための非侵襲的な月次共焦点検眼鏡検査または CSLO によって達成されます。閾値ベースの細胞SOMAセグメンテーションとモルフォを用いたライブ画像解析により、ミクログリア細胞数と活性化の変化を定量化します。

その結果、生きたマウスにおける月次CSLOイメージングを用いて、慢性神経変性の初期進行期におけるミクログリア細胞の密度分布と形態学的活性化の動態をモニターできることが示されました。GFP陽性ミクログリアマウス脳の2光子共焦点イメージングのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、網膜のCSLOイメージングにより、無傷の生物の老化による神経変性疾患の進行を通じてミクログリア細胞を直接観察およびモニタリングできることです。私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、exvivo を実証した後で、ミクログリアが検出可能な神経変性に先行する年齢の若い DBA から J マウスの中央準備において激しい活性化とクラスタリングを示し

検出可能な緑内障に先立つこれらの初期の自然免疫の変化が彼女の神経変性を引き起こしたかどうかを調べるためには、ミクログリアの変化を追跡するためのin vivoアプローチを確立する必要がありました。ライブ画像取得の手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるシーザー・ロメロです 操作を開始するには、CSLOシステムを起動し、セッション情報を入力します。次に、しっかりとイメージングの準備をします。

きれいな55度の広視野対物レンズを取り付けます。麻酔薬を投与してから2分後にイメージングプラットフォームにマウスを置き、私のタティックドロップを使用して両方の瞳孔を拡張します。5分後、マウスが麻酔をかけられていることを確認します。

次に、最小限の圧力で各目をコンタクトレンズで覆います。右目が対物レンズと接触し、軌道がレンズと平行になるようにマウスの向きを変えます。動物は拘束される必要はありませんが、対物レンズから一定の距離に保たれます。

次の10〜15分間、目をマウスと合わせると、マウスは動かず、まばたきもしませんが、CSLOライブイメージングシステムによって目の動きが追跡されます。イメージングセッションを開始するには、内側の網膜の眼底像を収集します。こちらは。

起波長820ナノメートルに対応する赤外線モードを選択します。次に、レーザー出力を100%に、感度を40〜60%に調整します次に、高速で作業し、ジョイスティックを使用して目の位置を特定し、検眼鏡の向きを調整し、視神経乳頭と網膜血管系の眼底ビューを収集する準備をします。角膜と水晶体に怪我や混濁がないか調べます。

画像取得に影響を与える可能性のある欠陥や怪我のある目を研究から除外します。次に、対物レンズを目に近づけることにより、視神経乳頭またはONHの表面である視神経乳頭領域を特定します。次に、画像を ONH の中央に配置します。

ONHを正しく配置することは、画像全体で均一なフォーカスとデミッションを得るための鍵です。次のステップは、ONHだけでなく網膜の内面も視覚化することです。参照焦点面には、網膜の硝子体表面にある主要な血管(59ジオプターと60ジオプターに相当)、または発掘された視神経乳頭領域の55ジオプターにさらに深く対応する主要な血管を使用します。

次に、タッチパネルのつまみを使用して、光ディスクの周りの眼底の大部分に白い照明のハローが広がるまで、画像の彩度を調整します。次に、その目に最適なコントラストを示す均一なハローをレンダリングする彩度を低く選択します。暗い領域が続く場合は、カメラの位置を再調整する必要があるかもしれません。

次に、リアルタイムで撮影された30フレームを平均して中心網膜の高解像度眼底画像を収集し、信号対雑音比を改善します。これは毎秒4.7フレームに相当し、すぐに正規化され、GFP陽性細胞の蛍光画像を収集するために準備されたのと同じ位置で正規化されます。タッチスクリーンパネルで蛍光イメージングモードに切り替えると、488ナノメートルのレーザー励起と460〜490ナノメートルのバリアフィルターセットを備えた青色レーザーが選択され、取得が100%のレーザー出力と100〜125%の感度に設定されます。

次に、ONHの平均100 xスキャンの単一のXYポイント二次元蛍光画像を収集します。次に、コントロールパネルでONHセレクトコンポジットの周りの網膜のマルチポイント画像をキャプチャし、次に検眼鏡で鼻の側頭軸を横切ってパンします。このソフトウェアは、新しくスキャンされた領域を自動的に平均化し、リアルタイムでステッチします。

網膜の領域の画質が平均化できないほど不十分な場合、スキャン対象の領域を識別する緑色の円が赤くなります。結果として得られる合成画像は、最大 1.7 x 4 mm の領域をカバーします。合成画像の取得には注意が必要です。

高解像度の画像は、スキャン平均化と画像スティッチングが完了する前に対物レンズを速く動かしすぎると失われる可能性があります。麻酔が切れ始めると、マウスの呼吸が激しくなり始め、イメージングが不可能になるため、イメージングセッションを終了する必要があります。まず、血管系と視神経乳頭を目印として、時系列の眼底画像を順次位置合わせします。

従来の画像編集ソフトでは、すべての画像をO hsが重なるまでライン化します。トップ画像はドラッグ中は半透明になります。次に、主要な血管が前の画像の血管系と重なるまでシーケンス内の各画像を回転させ、後で参照できるように配置を保存します。

各画像の補正角度を記録し、対応する単一のXYポイント蛍光画像に適用します。現在では、FluorレンダリングでアライメントされたTIFFファイルを開くことにより、中心網膜に局在する個々のGFP陽性ミクログリア細胞を同定することが可能になりました。すべてのセルを視覚化するには、画面全体にイメージを埋め込み、直交および補間されたレンダー ビューの合成を定義します。

次に、0.58、ガンマ 255、彩度、ポイント 255、輝度 195、アルファ、1.00 シェーディングのプロパティを定義します。表示されている両方のRGチャンネルを選択して、選択を終了します。ワークスペースフレームでBチャンネルをダブルクリックして非表示にし、個々のセルをセグメント化します。

赤チャネルを選択してしきい値を設定するには、大多数の細胞が最小のオーバーラップでマスクされるまで下限しきい値を上げ、上限しきい値を一定に保ちながら細胞プロセスを除外します。最後に、captureコマンドを使用して、マスクされたセルでファイルを保存します。マスクされたセルを含む画像をラスターグラフィックエディタで開きます。

直接観察するためにグレースケールを反転し、解像度を300DPI以上に調整します。RGB画像はTIFファイルとして保存されます。ライブ画像解析の次のステップはミクログリアであるため、セグメンテーションとモルフォを使用して、面積定量化のためのSATAを特定します。

閾値に基づく強度測定と物体カウントが可能なソフトウェアを使用してください。セグメント化されたセルを含む TIFF ファイルを開き、スプラインの再スケーリングを選択して解像度を最大化し、赤チャネルを黒と白にして視覚化します。次に、個々の細胞をセグメント化するために、年齢に応じて水平方向の直径を1.4〜1.7ミリメートルに定義して画像をキャリブレーションします。

したがって、MAは、赤チャネルに強度しきい値を適用します。オブジェクト数とアカウント更新コマンドの下のしきい値強度関数を開きます。この関数を使用して、個々の関心領域を表す各しきい値の 2 次元パラメーターを追跡します。

次に、強度ヒストグラムで強度のしきい値を定義します。255 レベルのうち最も低い 50 から 60% を選択し、個々のセルの最終的なしきい値を調整します。青色のしきい値カラーマスクと灰色のセル体周囲との間のオーバーラップを、バイナリツールバーコントロールまたはオブジェクトカタログを使用して視覚的に評価します。

複数の細胞で目的のソマ領域を手動で同定します。これらの要素を分離するには、関心領域を分離します。この間、トグルを使用して、エリア制限を使用してセルを直接視覚化します。

ミクログリア細胞を活性化細胞として分類します。彼らの体細胞面積が50〜60平方ミクロンより大きい場合。ミクログリアの体細胞が小さい場合は、不活性化として分類します。

最後に、プロセスを検証し、ソママスクとコントラストが50%増加した単一のXY点画像を重ね合わせることにより、各活性化ミクログリア細胞における分岐の複雑さを確認し、記載されたプロトコルを使用して、中央網膜の広い領域にわたってミクログリア細胞を可視化した。若いDBA 2 Jマウスヘテロ接合体でCX 3 C 1 GFPを発現し、高い細胞分解能とライブ画像、閾値化および形態測定分析を組み合わせることで、個々のGFP陽性細胞の自動セグメンテーションが可能になり、したがって、細胞は領域DBA 2 Jマウスモデル慢性緑内障に基づいて識別され、変数と一致する検出可能な神経変性が進行する年齢での局所的な微小神経膠症およびミクログリアの活性化の進行を監視するために毎月画像化されました個々の眼における神経変性の進行。この解析により、網膜ミクログリアの活性化とミクログリオーシスの経時的な変化が明らかになりました。

この分析では、個々の網膜内の総ミクログリアと活性化されたミクログリアの密度の動的な変化も検出されました。ミクログリアの集団密度は、GFP発現細胞密度の変化と関連しておらず、他の知見と一致していました。したがって、CSLO分析は、疾患の早期進行の指標として使用できます。

この手順を試みる際には、GFPとミクログリアの蛍光画像の飽和レベルを慎重に最適化することを覚えておくことが重要であり、内側の網膜を局在化させ、中心網膜のCSLO画像の再現性、ならびに中心網膜全体で検出される一貫した細胞の詳細性は、その開発後にこのステップに決定的に依存する。このライブイメージングプロトコルは、私たちの研究室で適用されており、網膜および視神経頭部ミクログリアの初期の変化と、DBAからJMへの緑内障のその後の進行との間の潜在的なリンクを真に落ち着かせています。このライブイメージング戦略により、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病など、網膜や視神経の変性を標的とする他の慢性疾患を早期に検出できる可能性もあります。