胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリングインビボとインビトロアッセイ
2015年6月9日
この記事では、胸腺沈降前駆細胞を特徴づけるためのin vivoおよびin vitroの方法論について、そのT細胞子孫の世代数、表現型、および数の動態を分析することによって説明しています。
この手順の全体的な目標は、E 13またはE 18胸腺沈降前駆細胞によって産生されるT細胞の生成と数の表現型動態を分析することです。これは、最初にE 13、E 14、およびE 18マウス胚から胸腺葉を単離することによって達成されます。第2ステップでは、E 14胸腺葉に照射し、次いでフローソーティングされたE 13またはE 18細胞を吊り下げ滴中で48時間コロニー形成する。
最終ステップでは、コロニー形成された葉を成体CD3ノックアウトマウスの腎臓嚢の下に移植します。最終的に、フローサイトメトリーを使用して、キメラ動物の血液中のE 13およびE 18胸腺沈降前駆子孫の存在を評価することができます。この技術の主な利点は、既存の方法の主な利点は、ineso細胞上のin vitro T細胞培養のように、この技術は、3次元アッセイで定義された前駆細胞からの完全なT細胞成熟を可能にする方法と、無傷のレシピエントマウスでの胸腺臓器臓器培養の移植を可能にする方法を組み合わせることで、胸腺slic前駆細胞と子孫の分化と機能を評価できることです。
げっ歯類の外科手術の専門知識を持つ研究エンジニアとして、私は層流フードでの移植実験の2日前に、70%エタノールで妊娠中の雌マウスの腹部を正中線で皮膚に縦方向に切開し、皮膚を引き離して切開を開き、鉗子とハサミを使用して消化管に触れずに腹膜を開きます。次に、二分子宮を引き出し、ハサミを使って膣から分離します。次に、40〜50ミリリットルのDPBSを含む90 x 15ミリメートルのペトリ皿に子宮を置き、各胚の脱落膜間を横方向に切断します。
細い先端のはさみと細かい鉗子を使用して、胎盤と卵黄嚢の間を切っている子宮の筋肉膜を取り除き、各胚を取り出します。次に、胚を保持している羊水を取り除き、HBSSと1%FCSを含む新しいシャーレに胚を置きます。胸腺を分離するには、双眼拡大レンズの下で胚を一度に1つずつ仰臥位に置きます。
次に、胸骨の軟骨に沿って縦方向に1本の鉗子を挿入し、湾曲した鉗子を使用して胸部グリッドをつまんで開きます。胸壁を脇に引っ張って、気管の両側にある胸腺葉を視覚化します。次に、細い鉗子で胸腺の下をつまんで、各葉を慎重に取り除き、1ミリリットルのHBSSと1%FCSを含むペトリ皿に入れます。
次に、2つの細い鉗子を使用して、葉を傷つけずに周囲の結合組織を取り除きます。その後、3ミリリットルのHBSSと1%FCSで葉を洗浄し、赤血球を除去して胎児胸腺臓器培養を開始します。E 14胸腺葉は、ちょうど示したようにCD 45.2胚から単離されました。
ローブを約3時間休ませます。次に、選別したばかりのE 13またはE 18胸腺沈降前駆細胞をスピンダウンします。ペレットを培地中に再懸濁し、培地35マイクロリットルあたり500細胞の最終濃度まで
。次に、60ウェルの寺崎プレートの他のすべてのウェルに35マイクロリットルの細胞懸濁液を滴下し、各滴の表面に照射ローブを1つずつプレートします。プレートを閉じて逆さまにして、細胞が重力によって液滴の頂端極に到達するようにし、逆プレートの上側を静かに打って、ローブを液滴の頂端端までスライドさせます。次に、逆プレートを加湿インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%で48時間インキュベー
トします。胸腺葉がコロニー形成された後、反射反応の欠如によってレシピエント動物の麻酔レベルを確認します。次に、各目に目の軟膏を一滴垂らし、マウスを層流フードの下の右側に置きます。次に、後肢の関節のすぐ上の手術領域を剃ります。
次に、滅菌手袋を着用し、70%エタノールと10%IOD DY DER溶液で手術野を滅菌します。メスを使用して皮膚組織を1.5センチメートル切開し、続いて筋肉組織を切開します。次に、切開部の両側にわずかな圧力をかけて、腎臓を腹腔から押し出し、生理食塩水で腎臓を湿らせます。
後腹膜腔の外側に綿棒で腎臓を維持し、2つの細い鉗子を使用してカプセルに2〜3ミリメートルの穴を開けます。次に、カプセルの壁を開いたまま、腎臓極の端に向かって最大6つの胸腺葉移植片を慎重にスライドさせ、腎臓を後腹膜腔に戻します。筋肉を縫合し、神経症を縫合し、続いて個々の外科医の結び目で皮膚を縫合します。
次に、創傷を10%ヨウ化物ポビドン溶液で濡らし、マウスを摂氏37度の加熱パッドに置き、動物と外科的創傷の両方が完全に回復するまで監視して、コロニー形成前駆細胞の発達のための内因性胸腺細胞を枯渇させるための最良の方法を決定します。この実験では、放射線療法または5日間のデオキシギン治療後のコロニー形成胸腺葉におけるT細胞再構成のレベルを比較しました。培養9日目にはコロニー形成リンパ球の数に差は見られませんでしたが、照射された葉には12日目にデオキシギンで処理されたものよりも多くのT細胞が含まれていたため、照射は胸腺コロニー形成後のT細胞の発達を促進するための好ましい治療法となり、ここでE13およびE18胸腺沈降前駆細胞の発生可能性を研究しています。 E 14を照射した胸腺葉は、観察されたように同数の2種類の前駆細胞でコロニーを形成し、E 13胸腺沈降前駆細胞は、E 18胸腺沈降前駆細胞よりも少ない胸腺細胞および二重陽性T細胞を生じさせた。
しかし、成熟したCD 3陽性細胞の頻度は増加し、樹状突起上皮T細胞の産生は、E 13胸腺沈降前駆細胞の子孫でのみ検出され、E 13およびE 18胸腺沈降前駆細胞のin vivo電位を分析しました。予想通り、今示した通りです。E 13胸腺沈降前駆細胞は、E 18前駆細胞よりも早くT細胞を生じさせましたが、循環T細胞の数はE 13胸腺沈降前駆体がコロニー形成動物全体で有意に少なかった後、この技術は、発生免疫学の分野の研究者がT細胞サブセットの特性を探求する道を開きました。 そのうちのいくつかは、哺乳類モデルにおける厳密な胚起源です。
このビデオを見た後、Timexの定住する先駆者とその子孫の微分的で機能的な経路を自然環境や競争条件で追跡する方法についてよく理解しているはずです。
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概要
本記事では、in vivoおよびin vitroの手法を用いて、胸腺に定着した前駆細胞とそのT細胞子孫を解析する方法について解説します。この研究では、これらの前駆細胞から産生されるT細胞の生成 kinetics、表現型、および細胞数に焦点を当てています。
主要研究構成要素
科学分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- 胸腺に定着する前駆細胞は、T細胞の分化において重要な役割を果たします。
- これらの細胞のキネティクスと分化を理解することは、免疫学的研究にとって不可欠です。
- 本研究では、マウス胚を用いてこれらの前駆細胞を探索します。
- 既存の手法では、定義された前駆細胞からT細胞を完全に成熟させることができない場合が多くあります。
研究目的
- 胸腺に定着する前駆細胞を特性解析すること。
- それらから分化したT細胞子孫の生成と表現型を分析すること。
- 既存のin vitro T細胞培養法を改善すること。
使用した手法
- マウス胚 E 13、E 14、および E 18 からの胸腺葉の単離。
- E 14 胸腺葉への放射線照射、およびそれに続くフローソートされた E 13 または E 18 細胞によるコロナイゼーション。
- 成体 CD3 ノックアウトマウスの腎臓被膜下へのコロナイズ済み胸腺葉の移植。
- キメラ動物の血液中における T 細胞系後代の存在を確認するためのフローサイトメトリー解析。
主な結果
- 本手法により、定義された前駆細胞からの完全なT細胞成熟が可能になります。
- 胸腺前駆細胞の分化および機能の評価に成功しました。
- キメラマウスにおいて、E 13およびE 18由来の子孫の存在を実証しました。
- T細胞開発のダイナミクスに関する理解が深まりました。
結論
- この手法は、T細胞の成熟を研究するための新しいアプローチを提供します。
- in vitroとin vivoの両手法を橋渡しすることで、包括的な解析を可能にします。
- 得られた知見は、胸腺前駆細胞の生物学的理解に寄与します。
よくある質問
業界における重要性
胸腺前駆細胞のキネティクスを理解することで、リンパ球減少状態におけるT細胞再構築の予測モデルが可能となり、細胞療法の設計に役立ちます。本手法は、in vitroでの前駆細胞評価とin vivoでの機能的検証を橋渡しすることで、初期の免疫療法標的の検証における機序的な曖昧さを軽減します。これにより、分化の時間軸とサブセット特有のアウトプットを明確にすることで、造血幹細胞および前駆細胞に基づいた戦略のリスク低減が支持されます。
バイオファーマ研究開発における戦略的活用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： E13およびE18の胸腺定着前駆細胞を単離することで、前駆細胞自体の分化能を調査し、自律的なT細胞系譜へのコミットメントを評価することを可能にする。
- 実用的価値： CD45同族標識を用いることで、遺伝子操作を行うことなく前駆細胞の流入を区別し、正確な機能比較のために本来の表現型を維持する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： ハンギングドロップ定着アッセイは、前駆細胞の生着および初期胸腺への播種効率を定量化するための、標準化され再現性のある3D微小環境を提供します。
- 実用的価値： 同一のストローマ条件下で前駆細胞バッチを並行して比較できるため、ニッチの変動を最小限に抑え、アッセイの回ごとの一貫性を向上させることができます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：免疫不全宿主への移植を通じて、in vivoで成熟T細胞の出力を経時的に追跡することを可能にし、短期培養では見られない、遅延しているが拡大したE18由来の末梢T細胞再構成を明らかにします。
- 実用的価値：T細胞置換療法の長期的な有効性の重要な予測因子である、持続的な免疫再構成の評価を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、前駆細胞の特性評価を初期の発見（表現型スクリーニング）と前臨床バリデーションの間に位置づけ、in vitroでのコロニー形成能をin vivoでの免疫再構築指標に結びつけるものです。
- 発見生物学：樹状上皮T細胞の生成など、前駆細胞サブセットにおける固有の分化速度やサブセットの偏りを比較することにより、仮説検証を支援する。
- スクリーニング：制御されたストローマ条件下での定量的な生着および初期定着指標を提供し、前駆細胞バッチ間の比較可能性を可能にする。
- 分析：フローサイトメトリーを用いて、血液および移植片における後代の表現型、頻度、および時間的ダイナミクスを測定し、比較分析のための多角的なリードアウトを提供する。
- トランスレーショナルリサーチ：in vivoにおいて前駆細胞の投入量と機能的なT細胞の出力を結びつけ、末梢免疫再構築の速度や組織への定着能の予測を可能にする。
- 企業利用・再利用：胸腺ストローマのサポートと免疫不全レシピエントが利用可能であれば、疾患モデル全般にわたって造血前駆細胞またはリンパ球系前駆細胞を評価するための再利用可能なプラットフォームを構築できる。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 前駆細胞の表現型を、樹状上皮T細胞のようなサブセット特異的な成熟を含む定義されたT細胞出力に関連付けることで、メカニズム上の曖昧さを低減します。
- 運用の価値： 放射線照射でコンディショニングした胸腺葉とハンギングドロップ法によるコロニー形成を通じて前駆細胞の評価を標準化し、研究室間の再現性を向上させます。
- 戦略的価値： T細胞再構成の速度と規模の両方を予測することで、前駆細胞を用いた治療におけるゴー/ノーゴー（継続か中止か）の決定に情報を供します。
- ポートフォリオへの影響： 発達速度と長期的な出力ポテンシャルに基づいた、リスク調整後の前駆細胞ソースの優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- マウス胚の解剖、胸腺葉の単離、および腎被膜下への無菌的外科移植の専門知識が必要である。
- 放射線照射した胎児胸腺葉へのアクセス、前駆細胞分取のためのフローサイトメトリー、および免疫不全受容体系統（例：CD3−/−）へのアクセスに依存する。
- 前駆細胞と胸腺葉の相互作用を一定にするため、標準化されたハンギングドロップ培養条件（37°C, 5% CO2, 48h）が必要である。
- 経時的な末梢T細胞の再構築を正確に評価するために、移植片の生存とリンパ球の流出の検証が必要である。
- マウス系に限定されており、ヒト前駆細胞への外挿には、種を超えた胸腺ストローマの適合性試験が必要となる。
