ラットヘッドBranchiomeric筋肉から衛星細胞の単離とキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目標は、第1、第2、および第4の上腕弓に由来する代表的な筋肉からサテライト細胞を分離し、細胞外マトリックス上で培養することです。ゲルスポット。これは、最初に若い成体ラットの虐殺、二胃筋、および口蓋筋を解剖することによって達成されます。

第2ステップでは、各筋肉サンプルからのサテライト細胞を酵素、消化、および持続時間によって単離します。その後、細胞を細胞外マトリックスゲル上で培養します。最終的に、サテライト細胞培養の筋形成の動的状態は、目的の筋肉マーカーの染色を通じて追跡できます。

口唇口蓋裂は、ヒトで最も一般的な頭蓋顔面奇形の1つです。裂け目が存在する場合、欠損を閉じ、正常な発話発達を可能にするために外科的修復が必要です、線維症、および欠陥のある筋肉の再生は、軟口蓋筋の機能回復を妨げる可能性があります。口蓋裂の修復後、わずかミリメートルサイズのエクソ細胞マトリックスゲルスポットコーティングを使用して、新たに分離された衛星細胞の培養のための革新的な方法を実証できます。

これにより、拡張の要件が回避されます。これらの細胞をアンディングする1日前に、隔離場所の8つのウェルチャンバーを100ミリメートルのペトリ皿にスライドさせ、皿を冷たい表面に移します。10分後、プレフィルドマイクロピペットを使用して、10マイクロリットルの細胞外マトリックスゲルを1滴ずつ各ウェルに分注します。

スライドをさらに7分間冷やした後、残りのゲルを完全に取り除き、翌日一晩で摂氏37度でウェルを乾燥させます。虐殺の筋肉を解剖するには、9週齢のラットの頭から皮膚を取り除き、皮下注射針を使用して頭を横に固定します。シリコンパッドで、耳下腺と顔面神経を分離し、腺を切除します。

次に、15番のメスの刃を使って、顔面神経を丁寧に取り除きます。咬筋筋の表在する頭部を特定します。次に、まっすぐな鉗子を使用して、頬骨突起で腱をその起源から分離し、続いて解剖ハサミで腱を慎重に切断します。

メスを使用して、下顎骨の枝の外側表面の角度と下半分に挿入されるまで、虐殺の表面の頭を解剖します。顎顎筋の後腹部を解剖するには、頭を仰臥位に針で固定し、舌下腺と顎下腺の両方を覆っている皮下脂肪を取り除きます。胃の筋肉の腹の前部と後部を露出させ、次に後腹の前腱をまっすぐな鉗子で保持し、腱を鼓膜の起源に慎重に解剖します。

levada vli palatino 筋肉を解剖するには、stylo halloid 筋肉を局在化します。横に引っ張り、筋肉組織を慎重に取り除きます。次に、鼓膜ブラーを挿入するlevada vli palatinoの腱をローカライズし、慎重に解剖します。

次に、食道を気管の後ろから持ち上げます。levada vli口蓋が挿入されている軟口蓋の領域を特定し、筋肉を緩めます。次に、筋肉を70%エタノールに浸し、抗生物質を補給した氷冷PBSに移します。

サテライト細胞を単離するには、各筋肉を6ウェルプレートの個々のウェルに移し、組織を2ミリメートルの小さな断片に切断します。筋肉をミンチにしすぎないように注意してください。次に、組織断片をウェルあたり2.5ミリリットルの0.1%プロナーゼ溶液に37°Cで60分間、20分ごとに穏やかに振とうしながら慎重にインキュベートします。

繊維が束になると、ウマの血清と抗生物質を各ウェルに補充した2.5ミリリットルのDMEMで外観が緩み、消化された組織を個々の15ミリリットルの円錐管に移します。組織スラリーをスピンダウンし、上清をデカントします。次に、各チューブに5ミリリットルの培地を加え、10ミリリットルのプラスチックピペットで組織を均質化します。

組織を再度スピンダウンし、上清を新しい15ミリリットルの円錐管に移します。次に、チューブにさらに5ミリリットルの培地を追加し、断片がピペットを簡単に通過するまでティッシュピースを再度トライレートします。別の遠心分離の後、上清を適切な対応するチューブに引き込み、細胞懸濁液を40マイクロメートルのストレーナを介して個々の50ミリリットルのチューブにろ過します。

ストレーナーを1ミリリットルのDMEMで洗浄し、細胞の回復を最大化します。次に、細胞をスピンダウンし、ペレットを新鮮な培地に再懸濁し、細胞をカウントして単離された衛星細胞を培養します。次に、細胞懸濁液を培養液10マイクロリットルあたり3個の細胞に対して1.5倍10に希釈する。

次に、事前に調製した各細胞外マトリックスゲルスポットに10マイクロリットルの細胞を加え、6時間後にゲルを摂氏37度でインキュベートします。各ゲルスポットに400マイクロリットルの培地を慎重に加え、スライドをインキュベーターに戻します。3日後、単離直後に適切な培地を添加して細胞の分化を開始します。

新たに単離されたサテライト細胞の90%以上がパック7を発現しています 4日目までに、パック7とMyoDは、すべての筋肉群のサテライト細胞によって発現されます。私のOGは、すべての筋肉群で7日目に高発現しています。細胞外マトリックスに播種した4日後、ゲルスポット、増殖細胞は融合し始め、7日目と10日目にミオシン重鎖を発現する小さな多核筋管を形成します。

長くてよく整理されたミオチューブは、10日目までに明らかになります。ミオ管のけいれんも観察できます。このプロトコルは、ブレアヘッドマッスルに由来するサテライト細胞の研究を可能にし、口唇口蓋裂の治療に新たな可能性を提供します。患者。