胚性メッケル軟骨でZebrabowクローン細胞分析によって軟骨細胞のインターカレーションと方向性増殖の可視化
2015年10月21日
頭蓋顔面骨の細胞組織が長いと仮定されず、直接可視化はありませんでした。マルチスペクトル細胞標識および in vivoライブで イメージングは、ゼブラフィッシュ下顎における動的な細胞の挙動の可視化を可能にします。ここでは、詳細プロトコルはZebrabowトランスジェニック魚を操作し、直接細胞のインターカレーションとメッケル軟骨における軟骨細胞の形態学的変化を観察します。
次の実験の全体的な目標は、ゼブラボウクローン細胞分析を通じて軟骨細胞の相互照合と伸長を視覚化することです。これは、SOX 10 ERT two Cree zebra bow Mラインを生成して、クローン分析用の頭蓋顔面軟骨および胚の組織特異的な組換えを達成することによって達成されます。次に、胚にタモキシフェンを10でパルス化しますので、組換えプロセスを誘導するために3時間ダニの段階を過ごします。
次に、CRE活性の発現と強い赤色蛍光またはRFPの発現のために胚を選択し、C頭蓋顔面軟骨のイメージングのために胚をマウントします。結果は、共焦点イメージングに基づく頭蓋顔面軟骨細胞のマルチスペクトル細胞解析を示しています。この技術の主な利点は、青色染色のSのような既存の方法や、SOPやGFPやSOXやkdeなどのトランスジェニック系統と比較すると、ゼブラボウを使用すると、臓器形成に関与するクローン細胞集団を特異的に観察し、追跡できることです。
初日の胚収集の準備として、胚がRFPフィルター付きの蛍光顕微鏡下で胚が10セルライト段階に達したことを光学顕微鏡で確認した後、翌日の午後5時から6:00の間に分割された交配水槽にソックス、10 ERTの2つのクリーシマウマ弓Mトランスジェニックゼブラフィッシュのいくつかのオスとメスのペアを設定します。真っ赤な胚を分離し、新鮮なE 3培地で新しいシャーレに移してクリー族の組換えを誘導します。10マイクロモルのヒドロキシタモキシフェン溶液をペトリ皿に加え、胚を摂氏28.5度で3時間インキュベートします。
次に、タモキシフェン溶液を生物学的廃棄物容器にデカントし、胚を一晩インキュベートした後、E 3を使用して胚を数回洗浄します。したがって、ダニの段階で、胚をE 3 PTU溶液に移し、インキュベーターに戻します。完全に発達したC頭蓋顔面構造を視覚化するには、網膜で強い赤色信号と黄色のクリー族の発現を示す4つのDPFで胚を選択します。トリカで胚を麻酔した後、テキストプロトコルに従って、きれいな共焦点スライド上のメチルセルロースの滴を含むペトリ皿に移します。
新鮮なメチルセルロースを一滴垂らし、マイクロローダーチップを使用して、25 x 25のカバースリップで直接触れないように注意しながら、背側に配置された胚をマウントします。胚を覆い、必要に応じてカバースリップを使用して胚を操作します。胚を画像化するには、20倍ドライレンズ対物レンズを使用します。
被写体に焦点を合わせるには、顕微鏡のL 100ボタンを押してから、共焦点セットアップボタンを選択します。[auto] をクリックし、チャネル 1 の CFP を選択し、チャネル 2 の GFP、チャネル 3 の RFP または M チェリーを選択します。次に、ウィンドウを閉じます。
チャンネル2とチャンネル3をオンにしてから、インターロックの解除ボタンをクリックします。次に、[再生]をクリックしてスキャンを開始します。設定を調整した後、目的の画像をキャプチャし、共焦点ソフトウェア形式と、チャネルごとの画像処理用のTIF形式で保存します。
CFPイメージングを行うには、フォーカスエリアを変更せずにチャンネル2とチャンネル3をオフにし、チャンネル1をオンにしてください。画像をキャプチャする前にスキャン設定を再調整し、説明したように画像を保存し、ここに示すようにpanと同僚の説明に従って画像処理を実行します。マウントシアン全体の青色染色による従来の軟骨の可視化は、発達中のメケル軟骨を観察する上で非常に貴重であり、最終的な細胞組織を視覚化して、経時的な系統追跡を通じて発達中の軟骨細胞をさらに分析するために一般的に使用されています。
SOX 10 kda トランスジェニック系統を使用して、Zebra bow m トランスジェニック系統のライブイメージングを使用して、生きた胚の細胞遊走と収束および伸長を研究しています。C頭蓋顔面骨格構造における軟骨細胞の組織化をさらに研究するために、メッケル軟骨の伸長と成長を媒介する軟骨細胞の相互照合と伸長のプロセスが明らかになります。この図は、3D PFから受精後5日までのUIシマウマ弓Mソックス10ERTからの下顎を示しています。
下顎は、ここに示すように、近接軟骨の細胞組織を明確に見ることができるように、腹側に描くのが最適です。安定して維持され、受け継がれた色彩により、系統のトレースや脳神経堤細胞の運命マッピングが容易になります。単一の青い細胞は、隣接する細胞とともに移動して補間し、その後、前後軸に沿って伸長して均一な形状の軟骨部位を形成し、したがって、メレス軟骨が前方に伸びるときに全体的な形状を維持します。
この技術は、ネコの発生分野の研究者がゼブラフィッシュの骨格形成におけるコンドロを調べる道を開くものです。
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概要
本研究では、Zebrabowトランスジェニック魚を用いて、ゼブラフィッシュの頭蓋顔面軟骨における軟骨細胞のインターカレーション（介在）と伸展を可視化するためのプロトコルを提示します。この手法により、器官形成過程における動的な細胞挙動を直接観察することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 細胞生物学
背景
- 頭蓋顔面骨の組織化については仮説が立てられていたが、直接的に可視化されていなかった。
- 軟骨細胞は軟骨の発達において重要な役割を果たす。
- 細胞挙動を研究するための既存の手法には限界がある。
- Zebrabow技術により、細胞集団のクローン解析が可能になる。
研究目的
- 軟骨細胞の介在および形態変化を可視化すること。
- 従来の手法に対するZebrabowの利点を示すこと。
- 当該分野の研究者に詳細なプロトコルを提供すること。
使用した手法
- 組織特異的組み換えのためのSOX 10 ERT2 Cre Zebrabow Mラインの作製。
- タモキシフェンによる胚のパルス処理を行い、組み換えを誘導する。
- CRE活性およびRFP発現に基づく胚の選別。
- 頭蓋顔面軟骨細胞のマルチスペクトル解析のための共焦点イメージング。
主な結果
- 軟骨細胞のインターカレーションおよび伸展の可視化に成功。
- 器官形成に関与するクローン細胞集団の提示。
- Zebrabow法と既存の手法との比較。
- 頭蓋顔面軟骨におけるダイナミックな細胞挙動に関する知見。
結論
- Zebrabow技術は、頭蓋顔面の発達を研究するための強力なツールを提供します。
- この手法により、軟骨細胞のダイナミクスの理解が深まります。
- 今後の応用により、発生生物学の他の領域へも展開できる可能性があります。
よくある質問
産業上の重要性
頭蓋顔面軟骨における軟骨細胞の組織化を理解することは、下顎骨の形態形成に関する機序的な洞察を提供し、頭蓋顔面疾患のターゲット検証に寄与します。Zebrabowクローン解析手法を用いることで、組織伸展を駆動する細胞挙動の直接的な可視化が可能となり、下顎発達の前臨床モデルにおける予測の信頼性が向上します。このような機序的なリスク低減の価値は、骨格パターニングおよび成長に関連する治療仮説の優先順位付けに役立ちます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：Meckel軟骨の伸展を駆動する軟骨細胞のインターカレーション（介在）メカニズムの解析を可能にする。
- 科学的価値：頭蓋顔面骨格パターニングに対するクローン寄与の機能的検証をサポートする。
- 科学的価値：下顎形成不全の表現型を規定する細胞挙動の直接的な観察を可能にする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 軟骨細胞のダイナミクスを定量的に評価するためのマルチスペクトル・クローン読み出しを生成する。
- 運用の価値： 軟骨形態形成のライブイメージングに向けた、再現性のあるリネージトレーシングプラットフォームを構築する。
- 運用の価値： アッセイへの適用に向け、発生段階の各時点における標準化されたクローン解析を可能にする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：クローナルな軟骨細胞の挙動と下顎の成長を関連付けることで、疾患に関連するシステムの重要性を明らかにする。
- 科学的価値：下顎形成不全の細胞学的根拠を明確にすることで、メカニズム面でのリスク軽減を支援する。
- トランスレーショナル価値：頭蓋顎顔面成長経路の発見から前臨床検証までの連続性を促進する。
パイプラインおよびワークフローの統合
Zebrabowクローン解析法は、軟骨細胞の介在と伸長のダイレクトな読み出しを提供することで、初期の創薬ワークフローに統合され、ターゲットバリデーションおよびリード化合物同定の段階に有用な情報を提供します。
- 発見生物学： 頭蓋顔面発生における軟骨細胞主導の組織伸長メカニズムに関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 定量的かつマルチスペクトルなクローン出力を提供し、軟骨細胞組織化の再現可能な評価を可能にします。
- 分析： クローン系譜追跡と形態学的指標を提供し、異なる条件下での細胞挙動の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： クローン軟骨細胞のダイナミクスを下顎形態形成に結びつけ、前臨床段階の連続性を支援します。
- エンタープライズでの再利用： 複数の器官形成研究に適用可能な、再利用可能なクローンイメージングプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：軟骨細胞の介在を直接可視化することにより、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用の価値：継承性の蛍光クローナル標識による標準化と再現性の確保。
- 戦略的価値：メカニズムの明確化により、顎顔面治療開発における生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響：下顎の成長およびパターニングに影響を与えるターゲットの、リスク調整済み優先順位付けに情報を活用する。
実施上の留意点
- トランスジェニックゼブラフィッシュのハンドリングおよびクローン系統追跡の専門知識が必要です。
- マルチスペクトルイメージングのための共焦点顕微鏡インフラストラクチャに依存します。
- 一貫した組換えを実現するために、標準化されたタモキシフェン誘導プロトコルが必要です。
- クローン解析を他の骨格系や組織系に適用する場合、適応に関する検討が必要になります。
- クローン誘導のための正確な胚ステージングおよび蛍光選択が必要であるという制限があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Embryo Collection, Tamoxifen Treatment, and Embryo Selection
2:46
Mounting Embryos in Methylcellulose and Fluorescence Microscopy
4:33
Results: Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation in ubi:Zebrabow-M;sox10:ERT2-Cre Transgenic Zebrafish
6:15
Conclusion
