げっ歯類からの急性海馬スライスを用いて、シナプスタグ付け/キャプチャとクロス捕獲調査

この手順の全体的な目標は、げっ歯類の Q 海馬スライスを使用して、CA One パラメタル ニューロンのシナプス タギング、キャプチャ、クロス タギングなどの長期的な可塑性とその結合プロセスを研究することです。これは、最初に脳を解剖し、海馬を冷たい酸素化された人工脊髄液にすばやく分離することによって達成されます。2番目のステップは、手動組織スライサーを使用して急性海馬スライスを調製し、それらをインターフェースチャンバーでインキュベートすることです。

次に、2つの刺激電極と2つの記録電極をCAに配置し、1つの領域に2つのシナプス入力からのフィールドEPSPおよびポピュレーションスパイク応答を記録します。最後のステップは、特定の時間枠内で、一度のシナプス入力で一時的な形の可塑性を誘発し、別の入力で永続的な形の可塑性を誘発することです。最終的に、両方の入力からのフィールドEPSP応答を長時間記録し、シナプスタグ付けキャプチャとクロスキャプチャのメカニズムを調査します。

シナプスのタグ付けとキャプチャは、特定の時間枠内で短期記憶が長期記憶にどのように変換されるかについての概念的基盤を提供します。この方法は、複数のシナプス入力からの刺激と記録を伴うため、実験ステップを学ぶのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるMahesh Shiraさん、macheteさん、maima Sharmaさんです。

この手順を開始するには、A CSFを準備し、95%の酸素と5%の二酸化炭素で泡立てます。インターフェースチャンバーの底部を蒸留水でその容量の約70%まで満たします。次に、摂氏32度にプリセットされた温度コントローラーをオンにします。

次に、蒸留水を高流量で流入チューブに流して上部チャンバーを10〜15分間洗浄し、その後、1分間1ミリリットル/分の流量でCSFに切り替えます。次に、上部チャンバーにネットを配置して、スライスの静止面を提供します。下部チャンバーがカルボゲンを開始し、連続的にカルボゲン化されているA CSFに流入チューブを浸します。

A CSFがカルボゲンで飽和し、上部チャンバーが満たされるまで20分間待ちます。このステップでは、かみそりの刃をティッシュチョッパーに取り付け、刃先が均等に揃っていることを確認します。小さな濾紙を刻んでテストし、ブレードがしっかりと固定されていることを確認します。

次に、スライド式バーニアマイクロメータを開始位置に設定します。次に、安楽死させたラットの頭を取得し、虹彩はさみを使用して、後頭蓋骨に切り込みを入れて脳幹を取り除きます。次に、頭蓋骨の右側に沿って小さな切開を行い、左側に長い切開を行います。

骨URで頭蓋骨を左側から頭蓋骨の右側に向かって慎重に取り外します。皮質とそれを覆う硬膜の薄い層を明らかにするには、細いへらで硬膜を慎重に取り除き、次に骨で前頭板を取り除きます。その後、へらの平らな端で皮質と小脳の間の接合部に特に残っている硬膜を取り除き、圧力を上向きに維持することで脳の損傷を防ぎます。

ヘラを使用して、冷たく炭酸化されたA CSFで満たされたアルミニウム冷却ブロックのペトリ皿に脳をそっとすくい取り、11番のメスを使用して海馬を分離し、小脳を取り除くためにまっすぐなカットを行い、脳の前部の4分の1を取り除くために別のカットを行います。次に、正中線に沿って浅い矢状に切り込みを入れます。正中線から開始します。

鎌状スケーラーで皮質を慎重に取り除き、背側の海馬を露出させます。その後、海馬の上の皮質の層を取り除きます。海馬交連に小さな切り込みを入れます。

鎌状スケーラーで、背側からローリングモーションを使用して海馬をそっと取り外します。その後、鎌状スケーラーの湾曲した端を使用して、孤立した海馬の周りの皮質と結合組織をすべて取り除きます。海馬組織をスライスするには、CSFを浸した30mmワットマン濾紙を手動スライサーのスライスステージに置きます。

海馬組織を濾紙に移します。鎌状スカラーの平らな端を使用して、濾紙を動かして、スライサーの刃に対して海馬を適切な向きに合わせ、海馬がfiaに対して約70度の角度でスライスされるようにします。次に、海馬組織を囲む余分な溶液を吸い取ります。

折りたたんだ濾紙で海馬を横方向にスライスし、スライスの形態が明確でない海馬の先端から組織を捨てます。次に、スライスのラウンドごとにバーニアマイクロメーターを調整して、残りの組織を400ミクロンの厚さのスライスにスライスします。各カット後、柔らかい毛のブラシを使用して、スライスをブレードから冷炭酸CSFで満たされた小さなビーカーにそっと移します。

次に、清潔なプラスチック製のパストピペットを使用して、スライスをスライスチャンバーのネットに静かに移します。先端が太い場合は、電極の位置と記録チェックが容易になるようにスライスの位置を慎重に調整し、スライスがA CSFの層に十分に囲まれているが、完全に水没していないことを確認します。その後、チャンバーを覆い、スライスをシナプス標識で2〜3時間インキュベートし、実験をキャプチャします。

顕微鏡下では、CAの層半径原子の2つの刺激電極を1つの領域でシェーファー側副繊維を刺激し、CAの頂端樹状突起領域の電極を記録するときは、刺激電極の中間に1つを配置します。F-E-P-S-P応答を記録するには、別の記録電極を層状に配置してください。人口急増を記録するためのDOレイヤー。

すべての電極がスライスに接触したら、テスト刺激を照射して、両方の入力で適切なフィールドEPSP信号が得られることを確認します。適切なF-E-P-S-P信号が得られたら、マニピュレータの微細な移動ノブを使用して、電極をさらに約200ミクロン慎重に下げます。その後、スライスが回復するまで 20 分待ちます。

その後、20マイクロアンペアから100マイクロアンペアの電流強度の範囲でフィールドEPSPの傾きを測定することにより、入力出力の関係を決定します。次に、各入力について、実験全体を通して一定の刺激として、最大フィールドEPSPスロープの40%を呼び起こす刺激強度を設定します。15〜20分後、ベースラインの記録を開始し、1つの入力でL-T-P-L-T-D誘導の少なくとも30〜60分前に安定したベースラインを記録し、単一の高周波刺激からなる弱いテチンプロトコルを使用して早期LTPを誘導します。

他の入力は、早期LTP誘導の30分後にベースラインを記録し続けますが、10分の列車間間隔で高周波刺激を繰り返す強力なテチンプロトコルを使用して、入力S 2で遅延LTPを誘導します。次に、Extended to DurationのフィールドEPSP応答を記録して、シナプスのタグ付けとキャプチャによるインプットS1の初期LTPから後期LTPへの変換を明らかにします。同様に、クロスキャプチャ実験では、最初に早期LTPを誘導し、1つの入力を30分後に別の入力で遅延LTD誘導します。これは、15分間で900回のバーストからなる強力な低周波刺激プロトコルを使用して行われます。

次に、フィールドEPSP応答を長時間記録して、クロスキャプチャによる入力Sの1番目の初期LTPから後期LTPへの変換を明らかにします。この表現では、2つの刺激電極がCAの1つの領域のラジウム層原子に配置され、2つの独立したが重なり合うシナプス入力を刺激します。CA上に1つのパラメタルニューロン、2つの細胞外記録電極。

1つは、頂端樹状突起コンパートメントからF-E-P-S-Pを記録するためのものです。そしてもう一つは、パラメタル細胞体から体細胞集団のスパイクを記録するもので、それぞれラジアルト層原子とパラ層に位置している。この図は、シナプスのタグ付けと捕捉を研究するための強力なパラダイムの前の週を示しています。

S 1に弱テチンを適用して早期LTPを誘導し、続いて30分後にS 2の強テチンを適用して後期LTPを誘導するが、この図はクロスタグを研究するための強いパラダイムの前の週を示している。早期LTPは、S1の弱いテチンによって誘導され、続いて、強い低周波刺激プロトコルを使用してS2の後期LTDが誘導されます。S oneで30分後、早期LTPは6時間続く後期LTPに変換され、クロスタギングとキャプチャを示します。

この解剖とスライス調製の手法を習得すれば、3〜5分以内に非常に迅速に実行できます。したがって、スライスの実行可能性を長期記録のために保持することができます。この方法を使用して、シナプスのタグ付けおよび捕捉プロセスに対するさまざまな薬理学的薬剤の影響もテストできます。

このビデオを見れば、長期的な機能可塑性実験の実施方法と、シナプスのタグ付けと捕捉のプロセスについて十分に理解できるはずです。