マイクロ流体精密小容量サンプル処理のためのプラットフォームとアコースティックマイクロデバイスで区切り生物学的粒子サイズのためのその使用

この手順の全体的な目標は、マイクロ流体光デバイスを使用して、小容量の粒子を自動的に分離することです。この方法により、バイオ検出や臨床研究アプリケーションのためのサンプルの堅牢な処理や分離など、バイオメディカルエンジニアリング分野での主要な手順が可能になります。この手法の主な利点は、モジュール性、精度、堅牢性、自動化であり、レティック分離だけでなく、マイクロ流体分離デバイスを介したさまざまな流れにも適応性と柔軟性があります。

私たちはまず、サブミリメートルの生物学的サンプル量で、分析種を大幅に希釈したり損失したりすることなく、日常的かつ確実に分離を行うこの機能の必要性を認識しました。サンプルの計量とソースからコレクションファイルへの自動ルーティングの統合、および標準的なシリンジポンプ操作は、この規模で成功するために重要です。まず、音響レティックデバイスと、付属のテキストプロトコルのセクション1で説明されている2つのフォトマスクのレイアウトを設計します。

次に、裏面の流体ポートを両面研磨された1 0 0シリコンウェーハにパターン化します。標準的なポジレジストフォトリソグラフィーを使用して、350〜400マイクロメートルの深さまで深い反応性イオンエッチングを使用してこの形状をエッチングします。次に、ウェーハを裏返し、前面の流体チャネル形状をパターン化します。

ここでも、標準的なポジレジストフォトリソグラフィーを使用して、パターン化されたウェーハを2番目のブランクシリコンキャリアウェーハにマウントします。フォトレジストを使用して、露光したチャンネルを200マイクロメートルの深さまでエッチングします。深層反応イオンエッチングを使用して、デバイスウェーハをレジストストリッピング溶液に浸し、ブランクシリコンウェーハからデットします。

次に、デバイスウェーハと特徴のない厚さ0.5mmのケイ酸ホウ素ガラスウェーハをピラニア溶液を使用して洗浄します。ここに示す条件を使用して、ガラスとシリコンウェーハをイオン的に結合する流体チャネルをクリーンシールします。最後に、2液性低粘度エポキシキットのダイシングソーにダイヤモンドブレードで個々の切りくずを切断します。

両方の成分の推奨比率を量り、十分に混合します。次に、リードのZirkin 8チタン酸またはPCTピエゾセラミックを適切な治具に置き、ピペットを使用して約10マイクロリットルのエポキシ混合物を均等に広げ、薄く均一な層を作成します。次に、チップを治具にセットし、ピゾセラミックのエポキシ面をマイクロ流体チップに合わせます。

位置合わせ中にチップを所定の位置に保持するために、チップをテープで留める必要がある場合があります。アセンブリを万力でクランプし、コンポーネントに亀裂が入らないように注意し、エポキシメーカーが推奨する温度と持続時間を硬化させます。エポキシが硬化したら、細い先端のはんだごてを使用して、細いゲージのワイヤーリード線をピゾセラミックの両側に取り付けます。

必要に応じて、適切なフラックスを使用してピゾ表面を調製します。ピゾとの接触はできるだけ短くしてください ピゾを熱的に脱分極させないようにするため。クランプ固定具を使用して、チップを流路ブレッドボードに取り付けます。

また、ブレッドボードに冷却ファンを取り付けて、音響実験中の温度を調整します。次に、チップとワールドコネクタをねじ込みます。ブレッドボードを顕微鏡ステージに取り付け、インレットとアウトレットの追加チューブにコネクタをチップ化します。

標準のクォーター28ネジ付きユニオンを使用。1つの16インチチューブの場合、マイクロ流体チップをシリンジポンプ、コンピューター制御のマルチポート選択バルブ、PCインターフェース流量計、およびチューブに接続します(ここに示されているように、付属のテキストプロトコルの図4で説明されています)。分離を実行する前に、洗浄試薬リザーバーを充填し、対応する流体ラインをプライミングします。

また、チップ出口のバルブ3と4を、最初に廃棄物貯留層に流れるように設定します。次に、冷却ファンをオンにします。pizoセラミックリード線をパワーに接続します amplifier、使用している音響チップの共振周波数に関数発生器を設定します。

RFアンプが目的の分離に応じて12〜25ボルトのピークツーピークを出力するように、ファンクションジェネレータの電圧設定値を調整します。次に、適切な収集バイアルとバッファーインプットバイアルをシステムに接続します。分離する細胞や粒子に適したサンプルバッファー、または分離後に使用する分析アッセイの必要に応じて、サンプルバッファーを使用してください。

次に、制御ソフトウェアをロードし、それを使用してバルブ、流量センサー、ポンプを制御し、全自動プライムおよび分離ルーチンを実行します。分離手順を開始する直前に、サンプルバイアルを短時間ボルテックスして、沈降した可能性のある粒子を再懸濁します。あるいは、サンプルを10回上下にピペットで動かして、ボルテックスによる損傷や凝集の影響を受けやすい生物学的サンプルを混合します。

次に、サンプルバイアルをインプットラインに取り付け、プライムおよび分離ルーチンを遅延なく開始します。まず、ソフトウェアを使用してバルブ1と2の吸気口をプライミングし、チューブに液体が含まれていないことを確認します。バッファーインプットバイアルをバルブ2に接続し、サンプルインプットバイアルをバルブ1に接続するチューブを同時にプライミングします。

シリンジポンプで両方のバイアルから約15マイクロリットルを引き出し、チューブを完全に満たし、それらをバルブに接続します。最後に、バルブ1と2を無駄に切り替えて、ローディングコイルに入った余分な液体や空気を排出します。次に、最初に毎分50マイクロリットルで25マイクロリットルの空気を引き出して、サンプルコイルをロードするようにプログラムを設定します。

次に、毎分200マイクロリットルで250マイクロリットルのサンプルをロードし、続いて毎分200マイクロリットルで35マイクロリットルの先行バッファーをロードし、最後に、毎分50マイクロリットルでさらに25マイクロリットルの空気をロードします。次に、シリンジポンプを装填された流体プラグを毎分100マイクロリットルで注入するように設定し、流量センサーを使用して小粒子出口と大粒子出口の流量を監視します。適切な流量比は、添付のテキストプロトコルに記載されているように決定できます。

フローセンサーが最初のエアギャップの通過を示す流量のスパイクを検出したら、対応する出力バルブを廃バイアルからサンプル収集バイアルに切り替えます。サンプルがチップを通過し、フローセンサーの読み取り値を観察して分離されるため、フローが安定していることを確認します。サンプルがチップを通過すると、分離されたフラクションは出口バルブに収集されます。

サンプルプラグの端で、フローセンサーを観察し、2番目のエアギャップを検出します。この時点で、出力バルブを無駄に戻します。全量が分注されたら、シリンジポンプの注入を停止し、自動化ルーチンを終了します。.

分離実験が完了したら、小粒子と大粒子のサンプル収集バイアルを切断し、その後の分析のために適切に保管します。サンプルピックアップチューブを空のバイアルに固定して、チューブを通して洗い流される余分な洗浄液を収集します。次に、付属のテキストプロトコルで説明されているように、自動システムクリーニングルーチンを開始します。

このプロセスでは、プログラムはバルブとシリンジポンプを制御して、保持コイルに洗浄試薬を順次ロードし、システムを介してそれらを洗い流します。自動洗浄および除染プロセスが完了したら、生物学的または化学的廃棄物を処理するための適切な手順に従って、余分なフラッシング溶液とそれらが収集したバイアルを廃棄します。ここに示されているのは、よく結合したピゾとマイクロ流体デバイスからの代表的な周波数スキャンです。

pizoとマイクロ流体デバイス間の結合が良好な場合、粒子は共振周波数にしっかりと焦点を合わせ、蛍光強度の明確なピークと予想される焦点位置への移動をもたらします。対照的に、結合が不十分な場合、粒子はうまく焦点を合わせず、必要なアプリケーションにとって高品質の集束または高速流が重要な場合、デバイスは不適切です。このグラフの各線は、さまざまなポリスチレン粒子サイズとPIZO駆動電圧を使用した分離結果を表しています。

一般に、より小さな粒子を抽出するには、より高い電圧が必要です。ただし、乾燥電圧は、熱放散が大きくなり、音響ストリーミングの影響が増大するため、無限に増加させることはできません。このプラットフォームの生体粒子分離への有用性を実証するために、平均直径8〜10マイクロメートルのヒトラジ細胞に直径約50ナノメートルのデングウイルスをスパイクし、音響マイクロ流体デバイスを使用して分離しました。

このようなシステムを組み立ててプログラムすると、分離を約5分で定期的に行うことができます。1時間に約3つのサンプルを、サンプル間の完全な洗浄と除染で処理できます。この手順に続いて、細胞計数、ウェスタンブロッティング、次世代シーケンシングなどの他の方法を実行して、分離の純度を確認し、生物学的意義を解明することができます。

このビデオを見れば、一般的なマイクロ流体分離デバイスの作製方法について十分に理解できるはずです。ワールド・ツー・チップ接続を使用してハードウェアとインターフェースし、自動分離手順を正確かつ堅牢に実行します。感染性物質の取り扱いは非常に危険であり、生物学的安全性のために適切な制度的に規定された機器と手順を使用して、適切に訓練された担当者のみが実施する必要があることを忘れないでください。