結腸幹細胞変異の定量

この手順の全体的な目標は、結腸幹細胞のグルコース 6 リン酸デヒドロゲナーゼまたは G 6 PD 遺伝子の表現型体細胞変異を定量化することです。推定遺伝毒性物質による動物の処理後、これは最初に、G 6 PD変異を持つ幹細胞の子孫が陰窩に完全に存在するのを待つ適切な時間を待つ薬剤で動物を治療し、動物を犠牲にし、結腸を取り除き、それをスイスロールに形成し、組織を液体窒素で凍結することによって達成されます。2番目のステップは、クライオスタットを使用して、結腸からのスライド上に厚さ7ミクロンの凍結切片を準備することです。

組織を摂氏37度に温めた後、組織切片の周囲に組織染色ごとのウェルを構築します。最後のステップは、組織切片をG six PD染色混合物でインキュベートし、次に光学顕微鏡下で切片を分析することですG 6 PD活性染色が青色で、表現型変異のある細胞は白っぽく見えます。最終的には、変異したクリップスの定量化を使用して、突然変異の頻度を決定します。

この技術は、幹細胞におけるグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ体細胞変異を測定するもので、これが結腸発がんにおける重要な細胞集団です。体性幹細胞の突然変異を同定することにより、突然変異の頻度を治療動物の結腸がんの発生と相関させることができます。この方法は、結腸の幹細胞変異に関する洞察を得ることができますが、他のモデル生物や臓器系にも適用できます。

幹細胞のニッチを特定できる場合、一般的にこの方法に不慣れな個人は、MBT溶液の調製に苦労します。可溶化します。MBTソリューションでは、詳細な手順に細心の注意を払う必要があります。2 ミリリットルのpH 7.4リン酸緩衝液を最適な切断温度の35ミリリットルまで、または50ミリリットルのチューブ内のOCT培地で組織学的染色溶液の調製を開始し、激しく振とうしてpHペーパーを使用して組み合わせます。

溶液が約pH 7.4であることを確認しました。次に、グルコース6リン酸とDPおよび塩化マグネシウム溶液をテキストプロトコルに示されているようにリン酸緩衝液に溶解し、再び、溶液のpHが約7.4のままであることを確認しました。M-M-P-M-S溶液を加え、激しく混ぜます。

これにより、透明で濃い赤色のホモジネートが溶液をホイルで包み込み、光への曝露を最小限に抑えることができます。溶液が濁った場合は、オイルバスの加熱中に廃棄する必要があります。別に、0.4ミリリットルのジメチルホルムアミド0.4ミリリットルの無水エタノールとMBTをOリング蓋付きの2ミリリットルチューブに混合することにより、5ミリモルのニトロブルーからテラズ発煙硫酸またはMBT溶液を調製し、チューブを緩く密封し、MBTが溶解するまでオイルバスで激しく沸騰させます。

次に、MBT溶液を室温まで冷ましてから、OCT反応混合物に加えます。溶液は、時間の経過とともに、最初のオレンジ色の赤から濃い赤または紫に色が変わる場合があります。動物を治療し、テキストプロトコルに示されているように凍結切片を調製した後、シリコーングリースフィットパルファムで接着された2つのスチールワッシャーを使用して組織染色用のウェルを作製し、ワッシャーのベースに溶液を配置する中心を切り取ります交換します。

戦前、冷凍ティッシュは摂氏37度の湿度の高い部屋で10分間スライドします。次に、ウェルをスライド上に置き、組織切片を、予め調製したG six PD染色混合物の約半ミリリットルで各組織切片ウェルに囲み、45〜50分間インキュベートします。暖かい部屋からスライドを取り外し、スライドからステンレス鋼のウェルを慎重に取り外します。

スライドを長い方の端に置き、反応ミックス混合物を排出した後、30〜60分間の洗浄と100ミリモルのリン酸緩衝液を洗浄します。G six PD染色液の最終的な微量を除去するには、スライドと脱イオン水を5〜10分間すすぎ、残留リン酸緩衝液を除去します。最後に、スライドにフルオロゲルを滴下して組織を密封し、30分間乾燥させて、後で分析するための画像を取得します。

スライドを光学顕微鏡に置き、DX倍率を4倍に調整します。次に、5.0メガピクセルのカメラで染色された組織切片の写真を撮り、調査した陰窩の総数を推定します。マウスごとに、表面積が最小のレベルからセクションを選択し、10 倍の倍率で画像化します。

ミュータントクリップの数を数えます。次の基準によると、地下室全体には青色がありません。地下室の外側の構造は無傷です。

変異体は隣接する7ミクロンのセクションで観察され、2人の観察者が同じ陰窩を変異体として識別します。このセクションの陰謀の数を視覚的に数え、各コロンでスクリーニングされたレベルの数を掛けます。DNA損傷剤であるアゾキシメタンで処理したマウスで観察された変異クリップの例は、ここで見ることができます 左側に、突然変異陰窩の垂直または上から見た図が見えます。

右側は水平または側面の図ですが、陰窩が突然変異体であると宣言されるためには、陰窩内のすべてのセルが残っている必要があります。少量の白を含む白い陰茎は、杯細胞からの粘液産生によるものです。突然変異の頻度は、観察された突然変異体の数を、突然変異体なしでスクリーニングされた陰窩の総数で割ったものとして計算されます。

処置に続いて、10倍からマイナス5倍までの1倍未満の突然変異頻度を示す対照マウスの結腸にクリップスが観察されたが、アゾキシメタン処理マウスは10の4.44倍からマイナス4の幹細胞突然変異頻度を示した。グルコース×リン酸デヒドロゲナーゼ変異の種類の遺伝的解析などの他の方法を実行して、化学薬品が突然変異をどのように誤ってコードするかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、変異原性化合物や発がん性化合物の可能性があるマウスの体性幹細胞の変異を測定する方法について十分に理解できるはずです。