2016年6月2日
この原稿は、莢梗塞のモデリング技術が記載されています。ここでは、手術前のターゲット・マッピング後の光の低強度で変性された光血栓技術を利用しました。この技術を使用して、我々は永続的な運動障害を持つ外接莢梗塞モデルを作成しました。
この技術の全体的な目標は、光血栓法を使用して、持続的な運動障害を伴う限局性被膜梗塞モデルを作成することです。莢膜梗塞を作製する前に、運動皮質の前肢領域にGFPを発現するアデノ随伴ウイルスを導入して、内部被膜内の前肢領域を特定する必要があります。麻酔をかけたラットを定位固定装置フレームに配置することから始めます。
次に、ラットの頭を剃り、70%アルコールとポビドンとヨウ素溶液を使用して頭皮を滅菌します。意図した頭皮切開の領域の頭皮の下に 2% リドカイン塩酸塩を注入して、術中の痛みを軽減します。眼の乾燥を防ぐために眼科用軟膏を塗布します。
そして、動物の上に滅菌ドレープを置きます。頭皮に2cmの正中線切開を行った後、定位固定装置の座標に従って運動皮質の前肢領域を特定するために、定位固定アームを配置します。この位置に入口穴を開けます。
ドリルで開けた穴に針を動かし、針を硬膜を通って運動皮質に1ミリメートル下げます。高精度のマイクロポンプを使用して、1マイクロリットルのウイルスをゆっくりと注入します。針管の逆流を防ぐために、針をさらに10分間そのままにしておきます。
10分が経過したら、針をゆっくりと引き抜きます。生理食塩水洗浄で手術部位を洗浄した後、3-0ナイロン縫合糸で創傷を固定します。次に、ラットを定位固定装置フレームから解放し、モニタリングのために回復チャンバーに移します。
術後の疼痛管理のために鎮痛剤を投与します。2〜3週間後、承認された方法に従ってラットを犠牲にし、凍結保護された脳を切片にします。GFPを染色した後、AAV-GFP形質導入された軸索を蛍光顕微鏡で内部カプセルで観察します。
蛍光画像に見られる形質導入軸索の位置をラット脳アトラスと比較し、形質導入軸索の定位固定座標を正確に決定します。光神経インターフェースを準備するには、まずカッティングドリルを使用して、スタイレットが入った27ゲージの脊椎針を約4センチメートル切断します。次に、光ファイバーのジャケットの10センチメートルを剥がします。
光ファイバーのジャケットを外した部分を金属管に挿入します。そして、繊維の周りにチューブを固定します。次に、押えを使用してclamp 金属管の下部1/2を2回
。金属管は、光ファイバーと脊椎針のハブとの間の空間を埋めます。光ファイバーに熱硬化型エポキシを塗布します。ハブの空きスペースに追加のエポキシを塗布します。
そして、光ファイバーを脊椎針に挿入します。エポキシを100°Cで20分間硬化させ、安定して固定します。硬化したら、脊髄針からはみ出している光ファイバーを切断し、ダイヤモンドラッピングシートで脊髄針の先端の光ファイバーを研磨します。
最後に、パッチコードのFCPCコネクタ部分をグリーンレーザーシステムのカプラーに接続します。次に、デジタル光パワーおよびエネルギーメーターを使用して、光ファイバーの先端からの光強度を測定し、光の正確な放出を確保します。動物の体の下にヒートパッドを置き、体温を摂氏37.5度に維持する手術を考えました。
以前と同様に、ラットに麻酔をかけ、手術の準備をすることから始めます。2cmのミッドライン切開を行った後、BregmaとLambdaが同じレベルに揃うまでノーズクランプの高さを調整します。内部カプセルを正しくターゲットにするには、正しい位置合わせが重要です。
脳定位固定アームを配置して、光血栓症の部位を特定します。次に、この時点で2ミリメートルの穴を開けます。次に、ONIの光ファイバー先端を研磨して清掃し、屈まずに脳定位固定装置フレームに固定します。
ONIの先端が清潔で無傷であることを確認してください。光インターフェースをラット脳の標的部位に挿入する前に、光ファイバーの先端からのレーザー強度を測定します。光ファイバーの先端でレーザー強度を3.5ミリワットに調整します。
次に、プロトコルの最初のセクションで決定された背腹座標を使用して、ONIを内部カプセルのターゲット領域に下げます。次に、ローズベンガルのキログラムあたり2ミリグラムを尾静脈から注入し、1分に設定されたカウントダウンタイマーを開始します。1分が経過したら、532ナノメートルの緑色レーザーを90秒間オンにして、梗塞を作り出します。
放射線照射後、ONIを脳からそっと取り除きます。手術部位を洗浄した後、3-0ナイロン縫合糸で傷口を固定します。次に、ラットを定位固定装置フレームから取り外し、回復チャンバーに移します。
この画像は、光血栓性病変の 2 週間後、2 ミリワットから 5 ミリワットまでのさまざまな強度のレーザー光線に対する梗塞病変の広がりを示しています。矢印は梗塞病変を示します。この実験設定では、光学光強度は3ミリワットから4ミリワットの間であると考えられています。
次の2つの画像は、光血栓症の3週間後の被膜梗塞の顕微鏡的な外観を示しています。ラット脳のこの冠状部分では、矢印のじりは、視床内の光ファイバーを含む針の管と内部カプセルまでの経路を示しています。これらの連続した寄り添った染色切片は、内部カプセル内の梗塞病変の程度を示しています。
矢印は梗塞病変を示しています。
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本稿では、改良された光血栓症法を用いた被殻梗塞のモデリング手法について記述します。このアプローチにより、持続的な運動機能障害を誘発する、境界の明確な被殻梗塞モデルの作製が可能となります。
この光血栓症法を用いることで、隣接する灰白質を温存しながら内包を選択的に標的とし、白質梗塞を精密にモデル化することが可能です。これにより生じる境界の明瞭な内包梗塞は持続的な運動機能欠損を引き起こし、神経治療候補薬のメカニズム的なリスク排除に向けた疾患関連システムを提供します。本モデルは、白質病変を標的とした介入策のターゲット検証および前臨床評価を可能にし、脳卒中研究における重要な空白を埋めるものです。
この手法は、ターゲットの同定から前臨床での有効性試験に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれており、神経治療戦略の反復的な洗練を可能にします。