三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

このイメージングおよび解析技術の全体的な目標は、複雑な信号から特定の情報を分離することです。具体的には、このプロトコルでは、表皮内の他のミトコンドリアとともに神経特異的なミトコンドリアを視覚化および定量化する方法について説明します。この方法は、健康な人の表皮内神経線維内のミトコンドリアが神経学的合併症のある患者の神経特異的なミトコンドリアとどのように比較されるかなど、神経学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、複雑な信号を取り、そこから特定の情報を抽出することです。このプロトコルは、これらのストローの信号などの特定の信号を周囲の信号から分離するのに役立ちます。皮膚生検の蛍光免疫組織化学染色の準備は、まずこの回路図に従って96ウェルプレートを標識します。

次に、150マイクロリットルのストックシグナルエンハンサー溶液をピペットで注入し、最上列の各ウェルへの二次抗体の非特異的結合を減らします。150マイクロリットルの1xリン酸緩衝生理食塩水を96ウェルプレートの2列目と3列目の各ウェルに追加して、リンスウェルを準備します。次に、150マイクロリットルの5%BSAブロッキング溶液を4行目のウェルに加えます。

一次抗体PGP9.5およびPDHを1,500マイクロリットルの1%BSAリンス溶液で希釈し、5列目の各ウェルに150マイクロリットルを添加する。接種ループを使用して、セクションを行 1 のシグナルエンハンサー溶液に移します。切片が5列目の一次抗体溶液に入ったら、プレートをラボフィルムでしっかりと包んで蒸発を防ぎ、フラットロッカーで室温で1時間サンプルを撹拌します。

摂氏4度で一晩ロッキングしてインキュベートします。手順の2日目は、150マイクロリットルの1%BSAリンス溶液を96ウェルプレートの列6、7、および8のウェルにピペッティングして開始します。蛍光色素標識二次抗体を1,500マイクロリットルの1%BSAに加える。

次に、150マイクロリットルの二次抗体溶液を9列目の各ウェルにピペットで入れます。ウェル6、7、および8を通過してセクションをすすぎます。切片が9列目の二次抗体溶液に入ったら、プレートをパラフィルムで包み、蛍光シグナルを保護するためにアルミホイルで覆います。

前回と同様にロッキングしながらインキュベートします。3日目に、滅菌ろ過された1x PBSの150マイクロリットルを10、11、および12列目にピペットで移します。サンプルを10行目に移し、プレートをアルミホイルで覆います。

ロッキングしながら室温で1時間すすぎます。次に、50マイクロリットルのろ過された1x PBSをスライドにピペッティングして、切片をマウントするための顕微鏡スライドを準備します。すすぎが完了したら、12行目のセクションをスライドに移し、DAPIを含む封入試薬を1〜2滴直接セクションの上に加えます。

50 mm x 24 mm の 1.5 mm 顕微鏡ガラス カバースリップをセクションにそっと置きます。スライドを室温で一晩暗所に置き、封入剤を硬化させてから、スライドを保管またはイメージングします。倒立型レーザー走査型共焦点顕微鏡で40倍油浸対物レンズを選択します。

核、神経線維、ミトコンドリアを画像化するための適切なレーザーと検出器を選択します。顕微鏡ソフトウェアに、12ビット強度分解能、2フレーム平均化による500ヘルツのスキャンレート、2.2のズームのスキャンパラメータを入力します。顕微鏡ソフトウェアを最適な横方向の解像度に設定するには、スキャン解像度を1024 x 1024に選択します。

軸方向の分解能と光学セクショニングを最適化するには、Zステップサイズが210ナノメートルの1つのエアユニットの共焦点開口を選択します。各信号を個別にスキャンし、検出器の電圧とオフセットを調整して、飽和度の高いピクセルと飽和不足のピクセルを削除します。神経信号のライブスキャンをアクティブにし、Zフォーカスコントロールを調整して、組織切片内の神経信号を包含する顕微鏡ソフトウェアの上部と下部の焦点面を見つけて設定します。

最終的なZシリーズをシーケンシャルスキャンでスキャンし、蛍光シグナルのクロストークを排除します。元の画像の複製画像に選択ツールを使用して表皮の周りの領域を描画することにより、角質層と真皮から表皮を分離します。次に、画像を選択してトリミングします。

「calculate spread function」機能を使用して、緑と赤の蛍光共焦点シグナルの点像分布関数を計算します。次に、オイルの中屈折率のパラメーターを 1.515 に設定し、40X オイル対物レンズの開口数を 1.25 に設定します。検出器のピンホールを1つのエアユニットにセットし、レーザー励起波長を選択します。

100%の信頼度、反復制限を10サイクルに設定した反復修復を使用し、緑と赤の蛍光シグナルの排泄には緑と赤のPSFを使用します。デコンボリューションされた神経信号の周囲に表面を作成するには、滑らかな機能、閾値の絶対強度、3, 000の下限閾値、65, 535の上限閾値を選択して、デコンボリューションされた神経信号の周囲にサーフェスを作成します。サーフェスを 10 ボクセルより上に保ちます。

神経表面の編集タブを使用して単一の非神経表面を選択するか、Controlキーを押しながら複数の非神経表面を選択することにより、非神経表面を削除します。Deleteボタンを押して、選択した非神経表面を削除します。神経表面の編集タブを使用し、マスクプロパティのマスクオールボタンを押します。

新しいウィンドウで、チャネル選択の下でチャネル5のミトコンドリアをデコンボリューションし、マスクを適用する前に重複チャネルを確認します。一定の内側/外側のラジオボタンを押し、設定されたボクセルの外側の表面を0.0に確認して、OKボタンを押します。最後に、サーフェス作成ツールを使用してミトコンドリア固有のサーフェスを作成し、smooth feature のチェックを外すと、しきい値処理にバックグラウンド減算を使用して、マスクされたデコンボリューションされたミトコンドリア信号の周囲にサーフェスを作成します。

最大の球の直径を 1.50 マイクロメートルに、下限しきい値を 2, 000 に、上限しきい値を最大 65, 535 に設定します。サーフェスは必ず 1.0 ボクセルより上に置いてください。この代表的な3D共焦点顕微鏡画像は、神経特異的な緑色蛍光シグナルを示しています。

神経信号に対してシアンで示された3Dサーフェスが作成されます。次に、神経表面をマスキングツールとして使用することにより、神経特異的なミトコンドリア信号が他の表皮ミトコンドリア信号から分離されます。結果として得られる神経特異的なミトコンドリア赤色蛍光シグナルは、神経表面内のミトコンドリアの周りにマゼンタで示される表面を作成するために使用されます(シアンで示されます)。

これにより、神経線維のミトコンドリアを詳細に見ることができます。ここでは、ミトコンドリア表面データをサイズ度数ヒストグラムとして表示し、さまざまなベンドのそれぞれに存在するミトコンドリアの割合をその体積に応じて視覚化します。この手順を試みる際には、染色プロセス中に組織をケアして、組織が溶液に完全に浸されていることを確認して、切片全体で均一で一貫した染色を提供することが重要です。

このビデオを見れば、ヒトの表皮内神経線維内のミトコンドリアを視覚化し、定量化する方法について十分に理解できるはずです。私たちの詳細なプロトコルは、神経障害などのミトコンドリアベースの神経疾患の病因の根底にあるメカニズムを理解することを目的として、他の研究者にヒトの皮膚生検を染色、画像化、処理、および分析する方法を教えるように設計されています。