無酸素状態下での堆積物コアセクショニングと間隙水の抽出
2016年3月7日
固体と流体の両方で酸化還元感受性種の分析を可能にするために、無酸素条件下で堆積物コアを切片化し、間隙水を抽出するためのプロトコルが提示されます。
この手順の全体的な目標は、堆積物コアを切片化し、元の酸化状態を維持しながらこれらの堆積物コアから細孔水を抽出することです。この方法により、地球化学分野の研究者は、湖や湿地などの酸化還元の影響を受けやすい地域の間隙水や堆積物における金属の種分化を調べることができます。この技術の主な利点は、柔軟性と適応性があり、現場での持ち運びが可能で、安価で、堆積物層を破壊しないことです。
その手順を実演するのは、私の研究室の学部生であるRahul Sinhaです。グローブバッグをセットして、フィールドラボの準備を始めます。まず、コアガイドプレートを作業面に固定します。
カウンターの前に伸びるコアライナーの穴を配置して、開いていることを確認します。次に、ベンチクランプを使用して窒素タンクを固定します。次に、グローブバッグをプレートの上に置き、バッグとガスレギュレーターの間にチューブを通します。
約8インチのチューブをバッグに伸ばします。次に、バッグのチューブ接続部を電気テープでシールし、バッグ内でクランプをチューブにスライドさせますが、クランプは開いたままにします。次に、プレートの穴の上にバッグの底にXを切り込み、リストされたアイテムをバッグにセットします。
アイテムを忘れるのは非常に不便なので、リストを再確認してください。次のタスクは、コアのセットアップです。まず、作業台の下の床にラボジャッキを置きます。
ラボジャッキには、コアを安定させるために中央に穴が開いた合板が必要です。次に、コアを直立させた状態で、コアガイドプレートとグローブバッグのXに押し込みます。コアの約4〜6インチがプレートの上に伸びている必要があります。
さて、1人がコアを支えながら、Xの周りのバッグにコアを電気テープでテープで固定します。次に、コア押出機をセットアップします。最初にハンドルを長さ6インチ、直径2インチのPVCスペーサーに挿入し、次に長さ3インチのカップリングに挿入し、次に別のスペースと別のカップリングをハンドルが完全に覆われるまで挿入します。
次に、コア押出機をコアの下に置き、ジャッキで支えます。ジャッキはできるだけ低くクランクする必要があります。次に、ボックスカッターで芯キャップの底の周りを丁寧に切ります。
コアライナーの周りにコアキャップのリングを残し、コア材料に対して円形のキャップを残します。ここで、1人がグローブバッグに手を伸ばしてコアを固定し、もう1人がジャッキを上げる必要があります。コア押出機を徐々にコアライナーに移動し、沈殿物を上向きに持ち上げます。
エクストルーダーを少し小刻みに動かす必要があるかもしれません。沈殿物とその上にある水がコアライナーの上部に達するまで、コアを上げ続けます。最後のタスクは、バッグを密封することです。
まず、すべてがそこにあることを再確認してください。次に、閉じ込められた空気が含まれているバッグ内のすべてのオブジェクトを開きます。次に、理想的には他の人の助けを借りて、手袋を3回パージします。
まず、バッグをできるだけ収縮させた状態で、メインの開口部を数本のバンジーコードで密封します。次に、50 psiの窒素流量を調整するアシスタントを使用して、バッグの周り、特に空気が閉じ込められる可能性のある隙間にガスを向けます。バッグが高度に膨らんでいる場合は、レギュレーターをオフにするか、clを閉じますamp ガスを遮断します。
次に、メインの開口部を開けて、バッグからできるだけ多くのガスを押し出します。すべての隙間を含む窒素をバッグに充填し、バッグをさらに2回空にするプロセスを繰り返します。これが完了すると、グローブバッグに含まれる酸素のレベルは非常に低いはずです。
グローブバッグに心地よい量のガスを入れて仕上げます。この手順は、ペアで作業しているときに実行するのが最適です。この手順では、バッグ内の内蔵手袋の上に使い捨て手袋を置きます。
これらの手袋が汚れたり破れたりした場合はいつでも交換してください。まず、シリンジを使用してコアの上部からすべての溜まった水を取り除きます。次に、この水を0.45ミクロンのシリンジフィルターでろ過します。
次に、コアライナーの上部にコアセクショニングリングを配置します。次に、沈殿物がリングの上部に出会うまでコアを上げます。バッグ内で、コアライナーを固定して、コアが動いたときにライナーが動かないようにします。
グローブバッグの内側で作業するオペレーターは、コア材料がリングの上部にくるように、コアライナーをわずかに押し下げる必要がある場合があります。次に、ライナーの上部とリングの間にコアスライサーを押し込み、沈殿物部分がスライサーの上にくるようにします。これは core の最初のセクションです。
プラスチック製のスプーンで、セクションを50ミリリットルの円錐形のチューブに移動し、しっかりとキャップをします。ツールを洗浄し、コア全体が切片化されてチューブに配置されるまでプロセスを繰り返します。コアセクショニングプロセス中に、ラボジャッキが完全に伸びることがあります。
これが発生した場合は、コアを所定の位置に保持し、ジャッキを下げ、PVCピースを配置してコア押出機を延長します。次に、ジャッキを元の位置に固定します。このプロセス中に、バッグがしぼんだり膨らんだりすることがあります。
窒素ガスバルブを短く開くか、メインバッグの開口部を短く開けてガスを放出して調整します。コアが切片化され、すべての沈殿物が遠心分離管に入れられたら、これらのチューブをグローブバッグから取り外してグローブバッグを閉じることができます。次に、テキストプロトコルで説明されているように、収集したチューブを遠心分離用に準備します。
その後、1,100g以上で20分間回転させます。遠心分離後、チューブを無酸素環境に戻し、サンプル収集用に空のチューブをいくつか導入します。その後、バッグは以前と同様に2〜3回再度パージする必要があります。
次に、遠心分離されたチューブを開き、端にチューブが付いたシリンジを使用して細孔水を取り除きます。次に、0.45ミクロンのシリンジフィルターを使用して、水を収集チューブにろ過します。テキストプロトコルは、サンプルをさらに処理する方法を説明しています。
記載されたプロトコルを使用して、ディープウォーターホライズン法案の9か月後にニューオーリンズ近くの湿地からコアが採取されました。この湿地はひどく油が塗られていました。Hach DR 2700ポータブル分光測色計を使用したところ、非常に高い硫化物濃度が示されました。
鉄濃度は低く、3プラス酸化状態の鉄は検出されませんでした。したがって、このビデオを見た後、グローブバッグの酸素をパージする方法、グローブバッグ内のコアを押し出して切片化を可能にする方法、および堆積物から細孔水を分離する方法をよく理解しているはずです。このテクニックを習得すると、コアの長さにもよりますが、コアあたり1〜3時間で実行できます。
この手順を試みるときは、グローブバッグを徹底的にパージし、コアの高さをゆっくりと調整することを覚えておくことが重要です。この手順に従うと、鉄による鉄のスペシエーション、ボルタンメトリーまたはカラム分離によるヒ素のスペシエーション、およびミシル水銀の分離などの方法を実行して、システムの酸化還元状態に関する質問に答えることができます。圧縮ガスでの作業は非常に危険であり、この手順を実行する際にはタンクを固定することが不可欠であることを忘れないでください。
一部の堆積物サンプルは危険物で汚染されている可能性があるため、適切な注意を払う必要があります。
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概要
本記事では、嫌気条件下で堆積物コアを分画し、間隙水を抽出するためのプロトコルを紹介します。この手法により、特に地球化学研究において、固体および液体の両方における酸化還元感受性種の分析が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 地球化学
- 環境科学
- 酸化還元化学
背景
- 堆積物中の金属形態を理解することは、環境評価において極めて重要です。
- 湖や湿地などの酸化還元に敏感な領域では、慎重なサンプリング技術が求められます。
- 正確な分析のためには、サンプリング中に元の酸化状態を維持することが不可欠です。
- 本手法は、現場での携帯性と費用対効果を高めるように設計されています。
研究目的
- 堆積物コアの分取のための信頼性の高いプロトコルを提供すること。
- 堆積層を乱すことなく間隙水を抽出できるようにすること。
- 多様な環境における還元・酸化感受性種の研究を可能にすること。
使用した手法
- グローブバッグを用いたフィールドラボの準備。
- コアガイドプレートを安定した作業台に固定。
- 酸化状態を維持したままの堆積物コアの分取。
- 後続解析のための間隙水の抽出。
主な結果
- 本プロトコルにより、堆積物コアの酸化状態を適切に維持することができます。
- 研究者は、間隙水中の金属形態を効果的に分析することが可能です。
- 本手法は、さまざまな現場条件に適応させることができます。
- 地球化学研究において、柔軟性と費用対効果の高さが実証されています。
結論
- このプロトコールは、酸化還元感受性環境を研究する研究者にとって有用なツールとなります。
- これにより、堆積物および間隙水の化学組成の詳細な分析が可能になります。
- 本手法の利点により、多様な地球化学的応用に適しています。
よくある質問
産業界における重要性
この手法は、環境マトリックス中の酸化還元感受性分析物の保存を可能にすることでバイオファーマの研究開発を支援し、これは毒性学および安全性薬理学研究におけるメカニズム的なリスク低減にとって極めて重要です。サンプル処理中に元の酸化状態を維持することで、本技術は下流のバイオマーカー検証および複雑な生物学的システムにおける化合物の挙動の予測モデリングに対するデータの完全性を保証します。また、現場への携帯可能性と低コストであるため、疾患に関連するシステムにおける初期段階の仮説検証を促進し、リード化合物の同定および前臨床ワークフローにおける不確実性を低減します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：硫化物や鉄の化学種などの不安定な物質を保存することで、疾患モデルにおける酸化還元依存性経路の解析を可能にし、機序的なターゲット検証を支援する。
- 実用的価値：堆積物コアから間隙水を分離するための再現可能なワークフローを提供し、環境毒性試験における一貫した試料調製を可能にする。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： アッセイの標準化に適した定量的に信頼性の高い間隙水抽出物を提供し、還元的に感受性のある経路を調節する化合物のスクリーニングを可能にします。
- 実用的価値： 嫌気条件下での高忠実度なサンプル抽出を容易にし、アッセイの再現性を向上させ、表現型スクリーニングキャンペーンにおける偽陰性を減少させます。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 前臨床モデルにおいて疾患の進行と相関する酸化還元感受性物質を保持することで、トランスレーショナルバイオマーカーの整合性を支援する。
- 実用的価値： ワークフローの各段階でサンプルの完全性を維持することで、探索から前臨床検証までの連続性を確保し、リスク調整後の進展決定におけるばらつきを低減する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、レドックス生物学アッセイのための信頼性の高いサンプル調製を可能にすることでディスカバリーの連続性に統合され、初期ディスカバリーにおける仮説検証をサポートし、メカニズム的にリスクが低減されたデータを通じてリード化合物の特定に寄与します。
- 探索生物学：酸化状態に敏感な分析物を保存することで、酸化還元活性が関与する疾患領域におけるターゲットバリデーションに不可欠な仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：酸化によるアーティファクトを最小限に抑えた孔隙水サンプルを提供することで、アッセイの準備状態と再現性を向上させ、信頼性の高い化合物評価を可能にします。
- 分析：硫化物や鉄の形態分析などの定量的アウトプットを提供し、実験群間での酸化還元条件の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：酸化還元ストレスのバイオマーカーを保存することで、前臨床段階での連続性を確保し、疾患モデルのバリデーションにおけるリスク調整後の意思決定を支援します。
- エンタープライズ再利用：環境および毒性学チームにとって再利用可能な機能として作用し、プロジェクトや地域をまたいだサンプルハンドリングの標準化を実現します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 酸化還元感受性物質の保持による予測精度の向上、および安全性薬理学におけるメカニズムの曖昧さの低減。
- 運用上の価値： フィールドおよびラボ環境における無酸素試料処理の標準化、再現性、およびスケーラビリティの確保。
- 戦略的価値： 酸化還元依存性アッセイにおける偽陽性の低減による、より的確なgo/no-go判断の実現と、早期スクリーニングにおける資本効率の向上。
- ポートフォリオへの影響： 信頼性の高い酸化還元バイオマーカーデータに基づく化合物のリスク調整済み優先順位付けを行い、後期段階における生物学的リスクを低減。
実施上の考慮事項
- 嫌気的手法および還元化学に関する専門的な科学的知識が必要です。
- 必要な機器には、グローブバッグシステム、窒素ガスレギュレーター、遠心分離機、およびシリンジフィルターが含まれます。
- チーム間での標準化には、酸素除去プロトコルおよびコアハンドリング手順に関するトレーニングが必要です。
- 適応上の考慮事項として、直径および堆積物の圧密状態に基づいたコアセクショニング厚の調整が含まれます。
- 実用上の制限として、最適化された条件下であっても、緩やかな酸化を防ぐために抽出後速やかに分析を行う必要があります。
