トロピック応答におけるカロース媒介Plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略

この手順の全体的な目標は、熱帯反応中の脳底媒介性体質ゲーティングに関与する遺伝子をスクリーニングすることです。この方法は、熱帯応答中にどの未知の遺伝子がplasmodesmataによる細胞間シグナル伝達を制御するかなど、植物発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、シンプルで、機能も、繰り返し再生できることです。

一般的に、この方法に不慣れな個人は、シロイヌナズナの黄化心軸を全プロセス中に損傷を受けずに取り扱うことが難しいため、苦労するでしょう。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、原形質ゲーティングにおけるグルコース合成酵素であるGSL8のルールを確立したときでした。オーディオで言及されている手順では、特別なセットアップと処理が必要だったために実行が困難な重要なステップが説明されていないため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

実験の1日前に、MurashigeとSkoog、またはMS培地を準備します。それをオートクレーブし、125ミリメートル四方のプレートにプレートあたり50ミリリットルのメディアを充填します。翌日、半乾燥プレートに1.1%次亜塩素酸ナトリウムで滅菌した種子を点在させます。

1mmのマイクロピペットの先端から、200マイクロリットルの水で種を点在させます。種子を1.8センチ間隔で5列に並べ、種子は列内で最低0.1センチメートル離れています。プレートをサージカルテープで覆って密封する前に、水を蒸発させます。

次に、プレートをホイルで包み、箱に入れます。ボックスを摂氏4度で3日間インキュベートします。3日間の冷処理の後、種子の箱を摂氏22度に3日間移します。

さらに3日後、暗い部屋で、緑色の光の下で種子の発芽状況を確認します。通常、生後3日のCol-0黄化苗は、長さが最大1.6センチメートルまで成長します。緑色のライトの下で、変化した光向性および重力応答を解析します。

滅菌されたピックを使用して、まっすぐな垂直に成長する同様のサイズの苗を選択します。他の部分に触れずに、子軸の最も低い部分から苗をそっと持ち上げます。次に、選択した苗を新鮮なMS寒天プレートに慎重に移します。

新しいプレートで、苗のフックを同じように向けます。各遺伝的背景の苗木を少なくとも20本選択して各列を作成し、すべてのプレートの複製を作成します。各プレートには、2つの遺伝子型が2列に並んでいます。

光屈性反応を確認するには、プレートをブラックボックスに配置して、苗が垂直に向くようにします。ボックスの片側をプレートの端まで開いたままにしておきます。次に、ボックスを片側白色光のある植物成長チャンバーでインキュベートします。

重力応答を確認するには、プレートをホイルで包み、苗が水平になるようにブラックボックスに入れます。いくつかの時点(通常は90分から始まり、12時間まで)で、暗い条件下でプレートを画像化します。スキャナーセットを使用して、600 DPI JPEG画像を収集します。

苗の曲げ角度を測定するには、ImageJソフトウェアに画像をロードします。拡大ツールを使用してズームインし、解析する苗までスクロールします。次に、角度ツールを使用して、苗が曲がる角度を測定します。

これを行うには、元の胚軸の成長方向ポイントAをダブルクリックし、マウスを曲げ開始ポイントBにドラッグします。次に、マウスを点Bから曲げ端の点Cにドラッグし、左クリックして2番目の線を描画し、角度Aを形成します。真の曲げ角度は角度Bで、180度から角度Aを引いたものに等しくなります。ここで、キーボードのMを押して角度Aを測定して記録します。結果ファイルは個別に開きます。

前の手順を繰り返して残りの苗木を測定し、データセットのスプレッドシートファイルを使用して2つの異なる背景の平均角度を測定します。このアッセイに必要なHPTSアガロースブロックの調製は、テキストプロトコールで説明されています。植物サンプルの準備から始めます。

この例では、plasmodesmataサイズの除外限界が変更された変異体が解析されます。まず、アッセイ用のプラットフォームを作成します。顕微鏡カバースライドを新しいMSミディアムプレートに置きます。

次に、3日齢の黄化苗が入ったMSプレートから、鋭利な手術用ハサミを使用してフックの付け根から苗を慎重に切除し、カバーガラスに移します。遺伝的背景ごとに少なくとも5本の苗木を移します。切除位置から0.5センチメートルの胚軸だけがカバースライドに残り、残りの胚軸が培地に触れるように苗を向きます。

次に、切除した苗の上にHPTSアガロースブロックを置き、切除された領域がHPTSブロックに接触するようにします。連絡がとられていることを確認してください。ブロックを胚軸に5分間置いておきます。

その後、倍水を入れた10mmシャーレに胚軸を移し、15分間振とうしながら洗います。次に、洗浄した苗をスライドに移します。各変異体をコントロールの隣に配置して、直接比較します。

胚軸を100〜150マイクロリットルの二重蒸留水で覆い、カバースライドを適用します。次に、テキストプロトコルで説明されているように、共焦点顕微鏡を使用してスライドを分析します。このアッセイには、2日未満の新鮮な調製済み染料を使用し、暗所に保管します。

de novoカロース合成を阻害するには、染料に1.5ミリモルの2-デオキシ-D-グルコースを添加します。このアッセイは、カルロース染色用の生後3日齢の黄化苗を選択することから始めます(トロピックレスポンスの有無にかかわらず)。細い手術用ハサミを使用して、フック部分から苗を切り取ります。

次に、つまようじの先端を使用して、2ミリリットルの染色緩衝液が入った小さなシャーレに苗を移します。暗所の染色緩衝液で苗を2時間インキュベートし、30 RPMで連続的に振とうします。染色後、苗木を二度蒸留水で2分間洗浄し、余分な染色緩衝液を除去します。

洗浄したら、共焦点分析のために各バックグラウンドの少なくとも5つの苗を選択します。ImageJソフトウェアでカロース信号強度を測定します。JPEG形式で保存した共焦点顕微鏡ファイルをイメージングソフトウェアで開きます。

次に、長方形の選択ツールを使用して、カーソルを画像にドラッグし、調査する領域を選択します。次に、Mを押して信号強度の数値を測定し、記録します。結果ファイルでは、「平均」という用語は、選択した領域の信号強度を示し、複数の領域の平均を示します。

この方法で、苗ごとに信号を1つずつ解析します。上記の手順を繰り返して残りの苗木を測定し、データセットスプレッドシートファイルを使用して2つの異なる背景の平均角度を測定します。記載されたプロトコルを用いて、AtGSL8のデキサメタゾン誘導性RNAi株を分析した。

DsGSL8の実生は、光屈性および重力に明らかに欠陥があった。彼らはどちらの力の影響でも曲がることを示さなかった。共形質運動の変化は、HPTSA色素の移動がdsGSL8 RNAiノックダウンにおいて、どちらの対照よりも大幅に広範であることを示しました。

Calloseはplasmodesmataのサイズ排除限界の主要な調節因子の1つであり、AtGSL8は知られているplasmodesmataのcalloseのシンターゼである。そこで、カロースアニリンブルー染色を行いました。コントロールでは、黄色の矢印でマークされているように、カロースが6時間後に蓄積しました。

しかし、6時間後、変異体は持続的に低血漿質カリロースレベルを示しました。このカロース合成の欠如は、光屈性後3時間という早い時期に測定可能なほど減少しました。このビデオを見た後、純粋にタロースを調節することにより、熱帯応答による体質藻質ゲーティングを制御するバリアントの遺伝子の迅速なスクリーニングを行う方法を十分に理解しているはずです。

習得すると、この技術はシロイヌナズナの苗の3日間の発芽後約6時間で行うことができます。この手順を試みるときは、苗を移す際に苗を傷つけないように注意することが重要です。また、ローディングアッセイ中に寒天と胚軸との間に適切な接触をすることも重要です。

この開発の後、この技術は、熱帯期の共形伝導性を制御する役割を果たす遺伝子、新しい遺伝子を探索するための発生生物学への道を開きました