デジタル画像相関を使用すると、血管の組織標本のローカル株を特徴づけるために、
2016年1月24日
私たちは、一軸引張試験を受けた血管組織サンプルの局所的な表面ひずみ場を特徴付けるために、デジタル画像相関の使用について説明します。これらの測定により、サンプルの機械的応答の正確な定量化と、構成的な応力-ひずみ関係の生成が容易になります。
このプロトコルの全体的な目標は、血管組織サンプルの局所表面ひずみ場を特徴付けることです。これは、一軸引張試験によるデジタル画像相関技術を使用して実現されます。この手法は、軟組織力学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ち、特に、ますます高度化する血管組織の計算モデルと数学的モデルを特定し、無効化するための情報を提供します。
この手法の主な利点は、サンプル表面のひずみ場の不均一性の正確な定量化を容易にすることであり、これは固有の材料特性、シンボル形状、および採用された試験モダリティの関数です。組織がラボに到着したらすぐに、外科用ハサミと鉗子を使用して腹部大動脈を周囲の組織から分離します。次に、PBSを充填したシリンジを使用して容器を3回洗浄します。
洗浄後、ハサミと鉗子を使用して、サンプルの完全性を損なうことなく、できるだけ多くの血管周囲組織を除去します。次に、容器の中央部分に鋭利なカミソリの刃を容器の縦軸に垂直に配置し、容器を3回切り刻んで2つのリングサンプルを作成します。次に、リングの1つにブレードを配置して、放射状にカットします。
リングをしっかりとスライスして、一軸機械試験用のストリップ形状のサンプルを作成します。これを両方のリングに対して行います。PBSに浸した100mmガラスシャーレに2つのサンプルを一時的に保管します。
サンプル表面に斑点を付けるために、組織マーキング染料をスプレーする準備ができているエアブラシを用意します。エアブラシを圧力バルブセットに接続して、100psiを生成します。次に、ティッシュマーキング染料を加えます。
ノズルの直径は、60 から 100 ミクロンのスペックル直径に合わせて校正する必要があります。次に、サンプルの内膜表面に組織マーキング色素を約5秒間スプレーします。これを3回繰り返して、スペックルパターンがサンプル表面を均一に覆うようにします。
まず、サンプルを試験装置に取り付けます。まず、サンプルの両端をティッシュ接着剤を使用してプラスチックストリップに貼り付けます。接着剤でサンプルの上部と下部の両方にプラスチックを置き、サンドイッチを作ります。
サンプルをティッシュマッティングボードの上に平らに置き、デジタルキャリパーを使用して寸法を測定します。次に、テスト装置のシステム制御を開始します。システムコントロールのホーム画面で、セットアップタブにあるタスクバーで波形を選択します。
次に、メカニカルテスターの上部グリップの位置をマイナスの4mmに調整して、システム内の指定された初期位置に対して4mmの延長を提供します。次に、1つのプラスチックストリップをメカニカルテスターの上部グリップにそっと固定し、サンプルを自由に吊るします。次に、サンプルの自由端が伸びずに固定できるように、下部グリップの位置を調整します。
次に、自由端に取り付けられているプラスチックストリップをテスターの下部グリップにそっと固定します。サンプルをマウントした状態で、システムロードセルをゼロにします。次に、サンプルの長さを測定し、これを全球円周ひずみを計算する際の基準長さとして使用します。
次に、ソフトウェアコントロールで、機械的テストプロトコルを入力します。ここでは、4つの一軸変位サイクルが適用されます。各サイクルでは、毎秒0.01mmの変位率でサンプル長が18%延長されます。
テストを文書化するには、数秒ごとに写真を撮ります。ローディングフレームから1.5m離れた位置にカメラをサンプルに対して垂直に配置し、サンプルに焦点を合わせます。画像キャプチャソフトウェアで、オプションで「システムを選択」PGR2を選択し、分析する画像を保存するプロジェクトパスを設定します。
タイムスクエアアイコンをクリックし、集録間隔を5秒に指定します。次に、取得した画像をインポートします。個々のスペックルを拡大し、この個々のスペックル内のピクセル数をカウントします。
スペックルパターンの品質を確認した後、システム内の「実行」アイコンと画像キャプチャソフトウェアの「開始」アイコンを同時にクリックしてテストを開始します。プロトコール全体を通して、サンプルが乾燥しないように、サンプルにPBSを断続的にスプレーします。ただし、これは、データ取得中ではなく、アンロードされた状態にあるときに行ってください。
画像解析ソフトウェアを開いた後、[スペックル画像]タブをクリックし、分析が必要なすべての画像を選択します。次に、長方形ツールをクリックして、最初の画像の関心領域を選択します。次に、31 x 31 ピクセルのサブセット サイズと 5 ピクセルのステップ サイズを入力します。
次に、ソフトウェアの[解析の開始]タブをクリックし、補間を最適化された8トラップに設定します。また、基準を正規化二乗差ゼロに設定し、サブセットの重みオプションをゴーシアンに設定します。しきい値オプションを確認します。
デフォルトになっているはずです。次に、[分析の開始]タブの下にある[後処理]サブタブをクリックします。オプション [string computation] を選択し、フィルターのサイズとフィルターの種類をデフォルトのままにします。
テンソルタイプをラグランジュに設定します。最後に、[データ]タブを選択し、解析された画像を選択して表面ひずみフィールドを視覚化します。2D DICは、一軸機械的試験と組み合わせて、さまざまな変形状態で血管組織試料の表面ひずみ場を測定するために使用されました。
組織の粘弾性性は、機械的プレコンディショニング前の低変位曲線のヒステリシスの程度によって注目に値しました。しかし、プレコンディショニングにより、ヒステリシスは徐々に減少しました。予想通り、局所的な円周方向のひずみ値は、サンプルの変位が適用されると増加しました。
円周方向のひずみは、サンプルグリップ界面付近と比較して、サンプルの中心付近で一般的に小さかった。長手方向では、サンプルが徐々に伸びるにつれて、サンプルの内膜表面に生じる不均一な圧縮ひずみが増加しました。全視野ひずみ測定の輪郭内の色の変化は、名目上一軸引張荷重を受けたときの大動脈の高い不均一性を明確に示しています。
次に、直交方向の表面ひずみ場の変動係数を、各実験状態で計算しました。表面ひずみの変動は、サンプルの伸長と反比例の関係にあることがわかりました。このビデオを見た後、血管組織サンプルの一軸引張試験と組み合わせたデジタル画像相関を使用して局所的な表面機械的応答を定量化する方法について、材料応答の高レベルの不均一性が表で定量化されます。
開発後、この技術は、軟組織力学の分野の研究者が血管組織の生理学的、病理学的、および調節された機械的応答を探求する道を開きました。
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概要
本研究では、一軸引張試験に供した血管組織サンプルの局所的な表面歪み場を特性評価するための、デジタル画像相関法の利用について説明します。この手法により、サンプルの機械的応答を正確に定量化することが可能となり、構成応力-歪み関係の導出に寄与します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 軟組織力学
- 生体力学
- 血管組織解析
背景
- 血管組織の機械的特性を理解することは、さまざまな生物医学的アプリケーションにおいて極めて重要です。
- デジタル画像相関法（Digital image correlation）は、変形を測定するために用いられる非接触光学的手法です。
- 一軸引張試験により、材料の機械的挙動に関する知見が得られます。
- ひずみ場を特性評価することで、血管組織の計算モデルの検証に役立てることができます。
研究目的
- 血管組織サンプルの局所的な表面歪み場を評価すること。
- 軟組織の力学に関する理解を深めること。
- 血管組織の計算モデルを検証するためのデータを提供すること。
使用した手法
- デジタル画像相関法。
- 血管組織サンプルの単軸引張試験。
- 周囲組織からの腹部大動脈の分離。
- 試験準備のためのPBSによる血管の洗浄。
主要な結果
- 試料表面における歪み場の不均一性の精密な定量化。
- 歪み応答に影響を与える固有の材料特性の特定。
- 形状および試験様式が歪み測定に及ぼす影響に関する知見。
- 構成的な応力-歪み関係の開発を裏付けるデータ。
結論
- デジタル画像相関法は、血管組織の力学解析に有効です。
- この手法は、計算モデルを改善するための重要なデータを提供します。
- ひずみ場を理解することで、応力下における組織挙動へのより深い洞察が得られます。
よくある質問
産業界への適応性と意義
血管組織における局所的な歪みの不均一性を正確に特性評価することは、心血管デバイスの設計や前臨床安全性評価に用いられる計算モデルのリスクを低減させるために極めて重要です。本手法により、生理学的に適切な負荷条件下での機械的挙動の精密な定量化が可能となり、血管病理学研究におけるターゲットの妥当性確認を支援します。組織応答モデルにおける予測の信頼性を向上させることで、治療法およびバイオマテリアルの開発パイプラインにおける早期の意思決定（go/no-go判定）に寄与します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：血管組織における固有の材料特性や病理学的変化を反映する局所的な歪み場を定量化することで、治療仮説の検証を可能にします。
- 運用的価値：再現性のあるフルフィールド歪み測定を提供し、サンプルの不均一性に起因する誤差が生じやすい平均的なグローバル指標への依存を低減します。
- 予測的価値：血管力学の計算モデルを検証または否定するための高解像度データを提供し、メカニズムに基づくリスク低減を支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：血管組織スクリーニングにおける標準的なバイオメカニクスアッセイの確立に適した、定量的かつ空間分解能の高いひずみ出力を生成します。
- 運用的価値：スペックルパターニングおよび画像キャプチャプロトコルにより、サンプル間で一貫した高忠実度なデータ取得を保証し、アッセイの準備を可能にします。
- 拡張性：単軸荷重条件下でのエンジニアリング組織、ハイドロゲル、またはポリマーバイオマテリアルの評価に向けたプラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：デバイスと組織の相互作用研究に用いられる計算モデルに定数データを提供することで、探索段階の力学的特性評価と前臨床検証を橋渡しします。
- リスク調整済みの進展：歪み場の不均一性を定量化し、血管インプラントやグラフト開発における安全マージンおよび性能閾値の策定に役立てます。
- バイオマーカーとの整合性：局所的な歪みパターンと、疾患関連の血管系における構造的または機能的な変化との相関関係の解明を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、リード化合物の同定および前臨床評価に先立ち、仮説検証、アッセイの標準化、およびデータ駆動型のモデル検証に資する局所的な力学的読み取り値を提供することで、創薬のディスカバリー・コンティニュアム（探索的連続体）へと統合されます。
- ディスカバリーバイオロジー： 血管組織における局所的な歪み分布に幾何学的要因や材料的要因がどのように影響するかを明らかにすることで、パスウェイの解明と生物学的リスクの低減を支援します。
- スクリーニング： アッセイにそのまま利用可能な定量的な歪みマップを提供し、異なる実験条件下での組織応答の信頼性の高い比較を可能にします。
- アナリティクス： 変動係数および全視野歪みテンソルを生成し、チームが不均一性を定量化し、機械的表現型を比較することを可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： インプラントの性能予測に用いられる有限要素モデルへの歪み由来のインプットを提供することで、前臨床ワークフローへと連携します。
- エンタープライズ再利用： 複数のプロジェクトにわたって、天然組織、エンジニアリング組織、およびポリマー軟組織に適用可能な、再利用可能なバイオメカニクス機能を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 従来の平均化手法では見落とされていた局所的な歪みの不均一性を捉えることで、組織挙動モデルの予測信頼性を向上させる。
- 運用的価値： 校正されたスペックルの塗布、制御された画像取得、および定義された解析パラメータを通じて、再現性と標準化を強化する。
- 戦略的価値： 血管治療薬およびデバイス開発に用いられる計算モデルの早期検証を改善し、後期の生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響： 客観的かつ高解像度な機械的フェノタイピングにより、血管ターゲットやバイオマテリアルのリスクベースの優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- 正確な歪み定量化のためには、生物力学的試験、画像取得、およびデジタル画像相関（DIC）ソフトウェアに関する専門知識が必要です。
- 高解像度カメラシステム、精密な変位制御が可能な力学試験機、および血管試料に適合する組織接着剤に依存します。
- 再現性のある結果を得るためには、スペックルパターンの品質、関心領域（ROI）の選択、およびサブセット／ステップサイズのパラメータについて、チーム間での標準化が必要です。
- 血管ストリップ以外の異なる組織の厚さ、形状、または材料剛性に適用する場合、調整を検討する必要があります。
- 表面へのアクセス可能性およびスペックルの密着品質による制限があり、弾性が非常に高い、あるいは脆弱な軟組織では信号の忠実度に影響を及ぼす可能性があります。
