呼吸器流体におけるウマヘルペスウイルス-2の診断のための定量的PCR法の開発と検証

qPCR法の全体的な目標は、ウマの生体サンプル中のウマヘルペスウイルス-2のウイルス量を評価することです。この方法は、馬の呼吸器疾患の診断分野における重要な質問に答えるのに役立ちます、開業医のための新しい解釈補助に関する定量的データ。この手法の主な利点は、感度が高く、特異的で、迅速な方法であることです。

もう一つの利点は、国際正常化委員会のフランス代表であるAFNORノルメNF U47-600に準拠した開発です。その手順を実演するのは、私のユニットの若い研究者であるErika Hueです。呼吸液の生物学的サンプルから核酸を抽出するには、ドラフトの下で、140マイクロリットルの生体サンプルを560マイクロリットルの溶解溶液に加えることから始め、室温で10分間インキュベートします。

560マイクロリットルのエタノールをサンプルに加え、630マイクロリットルの全溶液をシリカカラムに適用して遠心分離します。残りの630マイクロリットルをシリカカラムに適用し、再度遠心分離します。サンプルをカラムにアプスした後、洗浄バッファーAW1とAW2をそれぞれ500マイクロリットル使用して、カラムを2回洗浄します。

次に、カラムから核酸を溶出するために、50マイクロリットルの室温溶出またはAVEバッファーを追加します。キャップを閉め、室温で1分間インキュベートします。その後、6, 000 gで1分間遠心分離します。

DNAを増幅するために、テキストプロトコルに従ってプライマーとプローブを滴定した後、PCRマスターミックス12.5マイクロリットル、20マイクロモルのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、プローブの10マイクロモル、および22.5マイクロリットルに達するために必要な超純水を追加して、各反応ごとに22.5マイクロリットルの反応ミックスを調製します。コンタミネーションを避けるために、PCR反応ミックスは常に特定の領域で調製してください。適切な反応混合物の22.5マイクロリットルを96ウェルプレートの各反応ウェルに分注します。

抽出とPCRのネガティブコントロールを含めて、試薬が不要なDNAで汚染されていないことを確認します。次に、サンプル、抽出ネガティブコントロール、PCRネガティブコントロール、またはポジティブコントロールサンプルのいずれかの2.5マイクロリットルを対応する反応ウェルに加えます。次に、粘着プレートシールを使用してプレートを覆います。

そして、6, 000 gs で 10 秒間遠心分離します。プレートをリアルタイムPCRシステムに入れます。次に、ここに示すアッセイレイアウトとPCRプログラム設定のテンプレートを選択し、実行を開始します。

生データをリアルタイム PCR システムからスプレッドシートに転送した後、増幅プロットのしきい値をベースラインより上および指数関数的成長領域内に設定して、各サンプルのしきい値サイクルを取得します。各点標準セットを標準曲線としてプロットし、線形性を取得します。次に、標準曲線に基づいてさまざまなサンプルのコピー数を計算します。

qRT-PCR結果の検出限界を決定するには、90マイクロリットルの超純水を6本のチューブに分注します。削減ゾーンを標的とするプラスミドの60倍段階希釈液を調製するには、まずプラスミド作動希釈液から10マイクロリットルを90マイクロリットルの超純水でチューブに移します。チューブを短時間ボルテックスして遠心分離します。

次に、チューブから10マイクロリットルを次の水チューブに移します。ボルテックスと遠心分離の後、すべての水チューブがプラスミドを受け取るまで、移送を繰り返します。このビデオで前述したように、6回の10倍段階希釈でDNAを増幅した後、プラスミドの最後の希釈で陽性のシグナルを生成する除去ゾーンと、検出されない最初の希釈である除去ゾーンを決定します。

6つの2倍段階希釈液を調製するには、25マイクロリットルの超純水を6本のチューブに分注します。10倍希釈から正のシグナルを出したプラスミドの最後の希釈から、チューブから25マイクロリットルを最初の水チューブに移します。ボルテックスして遠心分離してから、示したように残りの5つの希釈液を準備します。

このビデオで前述したように、2倍段階希釈からDNAを増幅します。3 つの独立した試験から DNA を増幅した後、プラスミド濃度の各レベルについて、24 回の反復のうち陽性の複製数を計算します。95% の信頼度または 95% の PCR の信頼度で LOD を決定します。これは、24 回の反復のうち 23 個の陽性の反復が検出されるレベルです。

メソッドのLODを決定するには、正のシグナルを出した10倍希釈から、最後の濃度の4倍の濃度のプラスミドワーキング希釈液の25マイクロリットルから始めて、5つの2倍段階希釈液を準備します。増幅ステップで使用されるプラスミドは、汚染を避けるために特定の領域で調製されたプラスミドワーキング希釈液に由来します。これは重要なステップです。

プラスミドの各希釈液から 5 マイクロリットルを 135 マイクロリットルのネガティブリソース材料を含む 4 本のチューブに移し、5 つのポジティブ標準を 4 回繰り返します。5 つの陽性標準試料の 4 回の反復の抽出を行い、このビデオで前述したように増幅手順を実行します。プラスミド濃度の各レベルについて、8回の繰り返しのうち陽性の複製数をカウントします。

最後に、LOD メソッド (8 回のレプリケートのうち 8 回のレプリケートが正である最後のレベル) を決定します。このビデオで説明されている定量的RT-PCR法は、呼吸液中のウマ科ヘルペスウイルス-2を検出し、定量します。この実験では、10倍の段階希釈を行い、希釈率10から負の9番目と10から負の10番目の希釈の間にある削減ゾーンを推定しました。

LOD PCR 値は、除去ゾーンで新たに 2 倍段階希釈して決定しました。直線性範囲とLOQ PCRを決定するために、LOD PCR値を使用して、2.6、LOD PCR値、およびサンプルの2.5マイクロリットルあたり260,000コピーとの間の6つの10倍連続希釈の範囲を開始しました。LOQ PCRは、直線性範囲で最も低い濃度です。

このメソッド全体の特性評価は、呼吸器サンプルからのDNA抽出からターゲットの増幅および定量まで、qRT-PCRデータを取得するために必要なすべてのステップの検証です。qRT-PCR 全体の分析法の定量性能を、このグラフに示す精度プロファイルで評価およびバリデーションしました。EHV2ウイルスゲノムは、ここに示すように定量化された呼吸器疾患のあるウマの172の鼻腔スワブサンプルにロードされます。

ウイルスゲノムの負荷は若い馬で高く、最も高い負荷は10の1.9倍から11ミリリットルあたり検出されました。この手法を習得すると、増幅ステップごとに2時間未満で完了し、適切に実行すれば、検証ステップの合計を4週間未満で実行できます。この手順を試行する際には、特にプラスミド溶液を扱う際には、汚染のリスクを避けることを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、ゲノム同定などの追加の質問に答えるために、シーケンシングなどの他の方法を実行できます。このビデオを見れば、DNAの抽出と増幅を行う方法と、そのPCRリザーブを特徴付ける方法について十分に理解できるはずです。病原体のような生体サンプルを扱うことは、非常に危険であることを忘れないでください。

この手順を実行するときは、フードでの作業や、適合したセキュリティレベルのエリアなど、いくつかの予防措置を常に講じる必要があります。