マウスにおけるGPCRヘテロマーの行動機能を研究するためのキメラ構築物のHSV媒介導入遺伝子発現
2016年7月9日
この記事では、GPCRヘテロマーの形成を必要とする行動アッセイをテストするために、マウスの前頭皮質にウイルスベクターを注入する方法について説明します。
この方法の全体的な目標は、ウイルスを介した遺伝子導入が、マウスモデルにおけるGタンパク質共役受容体のヘテロ二量体化を必要とする行動表現型にどのように影響するかを観察することです。この方法は、神経および精神薬理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。具体的には、gタンパク質共役型受容体が分子レベルでどのように相互作用するかです。
この方法を使用することにより、統合失調症やうつ病などの精神障害のモデルで、この相互作用が行動にどのように影響するかを理解できます。この方法を使用して、統合失調症の患者を治療するために使用される薬物の作用機序に関与していることが示されています セラトニン 2a と代謝型グルタミン酸受容体 2 を具体的に見ていきます。承認された方法に従ってマウスに適切に麻酔をかけることから始めます。
つま先をつまむことを行い、反応がないことに注意することにより、麻酔の手術面が得られたことを確認します。次に、目を保護するために眼科用ジェルを塗布します。マウスを定位フレームに取り付け、頭蓋骨が水平で平らになるように頭の傾きを調整してください。
露出した頭皮にポビドンヨウ素を塗布します。メスを使用して、露出した剃毛領域内の頭蓋骨の正中線に沿って矢状切開を行います。次に、切開部位の皮膚にピュアライトクランプを取り付けて、頭蓋骨が露出したままであることを確認します。
過酸化水素を塗布して骨膜を溶解し、頭蓋骨の縫合糸を露出させます。ブレグマと縫合糸が見えてきたので、頭蓋骨が水平になるように定位フレームを調整してください。シリンジの針先をブレグマに合わせ、ブレグマの座標を記録します。
前頭皮質を両側に注入するには、記録された吻側尾側ブレグマ座標に 1.6 mm を追加し、記録された内側外側ブレグマ座標に 2.6 mm を追加します。頭蓋骨に注射部位に印を付け、注射部位に小さな穴を開けます。コットンチップアプリケーターで、余分な血液や骨片を拭き取ります。
針を脳の表面に持ってきて、背側腹側座標の深さまで下げます。次に、針のプランジャーをひねってシリンジの内容物をゆっくりと注入し、0.5マイクロリットルの注射のために毎分0.1マイクロリットルを5分間投与します。シリンジを5分間そのままにしておきます。
割り当てられた時間が経過したら、動物を定位固定装置から取り外し、切開部を閉じ、加温パッドの上に置きます。承認された動物のプロトコルに従って術後鎮痛を投与します。ウイルス粒子の定位注射の2〜3日後に行動試験を行います。
実験開始の少なくとも4時間前にマウスを部屋に慣れさせます。まず、DOIを0.9%生理食塩水に溶解し、1キログラムあたり2ミリグラムにします。寝具のないホームケージを用意し、三脚を使用してカメラをホームケージの真上にくるように調整します。
ホームケージ全体が視野に入るようにカメラを調整します。マウスの体重を量り、0.9%生理食塩水またはDOIのいずれかの適切な用量で腹腔内注射します。マウスをホームケージに10分間戻します。
10分後、マウスを空のホームケージの中央に置き、カメラの視野に死角がないことを確認します。ビデオカメラの録画ボタンを押して部屋を出ます。30分後、録音を停止し、マウスを元のホームケージに戻します。
次のマウスで動作テストを繰り返します。レフリーに実験条件を知らせずにビデオを見てもらいます。ビデオ全体のすべての頭のけいれんを手動で記録します。
頭のけいれんは、マウスによって行われる急速な揺れる頭の動きとして定義されます。プロトコルの書面による部分に概説されているようにデータを処理します。ここに示されているのは、前頭皮質におけるHSVを介した導入遺伝子発現の代表的な画像です。
HSV mGlu2 GFPを前頭皮質に注入し、免疫細胞化学によってGFPの発現を明らかにしました。このスケールバーは200ミクロンを表します。この画像は、mGlu2ノックアウトマウスの前頭皮質におけるHSVを介した導入遺伝子発現と抗mGlu2反応性のウェスタンブロットを示しています。
ここでは、モノマーとしてのmGlu2の免疫反応性を測定しました。このヒストグラムは、mGlu2ノックアウトマウスの前頭皮質におけるウイルス媒介性のmGlu2の発現が、幻覚誘発性セラトニン2a受容体アゴニストDOIによって誘発される頭部のけいれん反応を有意に救うことを示しています。この実験で最も重要なステップは、ウイルス注射の間のタイミング、頭部のけいれん反応、およびマウスが犠牲になるタイミングです。
遅延があると、実験の結果が変更されたり、データにあいまいさが生じたりする可能性があります。習得すると、マウスの手術はウイルスを注入するのに約30分かかります。頭のけいれんの実験も、マウスあたり約35分かかります。
ずらして手術をしたり、一度に複数のマウスで手術したりすることをお勧めします。このようにして、ウイルスコンストラクトのピーク発現時間である手術後3〜4日で頭部のけいれん実験を行うことができるタイムラインを維持できます。ご覧いただきありがとうございます、そして実験の頑張りを祈ります。
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概要
本記事では、マウスモデルにおいて、Gタンパク質共役受容体（GPCR）のヘテロ二量体化を標的としたウイルス介在性遺伝子導入が行動に及ぼす影響を調査する方法を提示します。具体的には、幻覚剤投与後の頭部ピッチング反応（HTR）を行動指標として用い、精神病に関連する行動の文脈におけるセロトニン2A（5-HT2A）受容体と代謝性グルタミン酸受容体2（mGlu2）の相互作用を検討します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経薬理学
- 行動神経科学
- 分子神経科学
背景
- 5-HT2A-mGlu2などのGPCRヘテロ量体複合体は、統合失調症などの精神疾患に関与している。
- マウスにおけるヘッドツイッチ反応（HTR）は、幻覚剤の作用を評価する確立された行動解析法であり、5-HT2A受容体の機能に依存する。
- 先行研究により、mGlu2ノックアウトマウスでは幻覚剤に対するHTRが減少することが示されており、5-HT2A介在性の行動におけるmGlu2の役割が示唆されている。
- これらの行動において5-HT2A-mGlu2受容体複合体が不可欠であるかどうかは、これまで直接的に検証されていなかった。
研究目的
- 5-HT2A-mGlu2ヘテロマー受容体複合体が、マウスにおける幻覚剤誘発性の行動反応に必要であるかを確認すること。
- mGlu2またはキメラmGlu2構築物（ヘテロマー複合体を形成できないもの）をウイルス介在的に発現させ、mGlu2ノックアウトマウスにおいてHTRを回復させることができるか評価すること。
- in vivoでのGPCR相互作用を研究するための方法論的な枠組みを提供すること。
使用方法
- 麻酔下にあるマウスの前頭皮質へ、単純ヘルペスウイルス（HSV）コンストラクトを両側注入するための定位手術。
- ウイルスベクターを用いた、野生型mGlu2またはキメラmGlu2/mGlu3コンストラクト（mGlu2ΔTM4N）のいずれかの発現。
- 幻覚剤DOIの投与後における、頭部ピクつき反応（HTR）を用いた行動試験。
- 前頭皮質における導入遺伝子の発現を確認するための免疫細胞化学染色およびウェスタンブロッティング。
主な結果
- mGlu2ノックアウトマウスの前頭皮質において、HSVを介してmGlu2を発現させると、DOI誘発性のヘッドツイッチ反応（HTR）が有意に回復した。
- 5-HT2A-mGlu2複合体を形成できないキメラmGlu2構築物を発現させても、HTRは回復しなかった。
- 免疫細胞化学染色およびウェスタンブロッティングにより、標的とした脳領域における特異的かつ成功裏な導入遺伝子の発現が確認された。
- ウイルス注入、行動試験、および組織採取のタイミングは、実験の成功において極めて重要である。
結論
- 5-HT2A-mGlu2ヘテロメリック受容体複合体は、マウスにおける幻覚剤に対する完全な行動反応に必要である。
- ウイルス媒介遺伝子導入は、GPCR相互作用の分子的な要求性をin vivoで解析するための有効なアプローチである。
- 本手法は、精神疾患に関連する行動の分子基盤を研究するための有用なツールとなる。
よくある質問
産業界における重要性
マウスにおけるHSV介在性外来遺伝子発現を用いてGPCRヘテロマーの行動学的機能を解析することは、神経精神科領域の創薬における重要な課題である、受容体複合体と疾患関連表現型との間のメカニズム的な関連性の構築に取り組むものです。このアプローチは、特定の受容体相互作用の機能的必要性を切り分けることにより、精神疾患のターゲット検証における予測精度を高めることを可能にします。本手法は、初期探索とトランスレーショナルリサーチの接点において、リスクを調整したポートフォリオ決定を支援します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- in vivoでGPCRヘテロマーの機能を直接的に検証でき、メカニズム的なリスク低減が可能になる。
- 疾患に関連する行動表現型において、特定の受容体複合体の必要性を明確にする。
- 神経精神疾患の適応症に対する標的選択の予測精度と信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームのスクリーニングに向け、分子介入に関連した検証済みの行動アッセイを確立する。
- アッセイの標準化のため、定量的な行動出力（頭部ピクつき反応）を提供する。
- in vivoにおける遺伝学的および薬理学的操作の再現可能な評価を促進する。
翻訳および前臨床研究
- 受容体複合体の解析を通じて、前臨床行動モデルをヒトの疾患メカニズムと整合させます。
- 分子レベルの発見から動物モデルにおける行動学的検証までの連続性を可能にします。
- 分子介入を定量可能な表現型に結びつけることで、トランスレーショナルなバイオマーカー開発を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、疾患に関連する行動系において受容体複合体機能の仮説に基づいた検証を可能にすることで、初期の探索段階と前臨床での検証を橋渡しするものです。
- 基礎生物学研究： 精神疾患の表現型におけるGPCRヘテロマーの関与について、帰無仮説の検証をサポートします。
- スクリーニング： 遺伝学的または薬理学的な摂動後の定量的行動リードアウトのためのプラットフォームを提供します。
- 分析： 実験群間の統計的比較のために、測定可能なエンドポイント（ヘッド・トゥイッチ数）を提供します。
- トランスレーショナル研究： 分子レベルの介入を、精神疾患に関連する行動結果へと結びつけます。
- 企業の再利用： 他の受容体複合体をin vivoで解析するための、再利用可能なワークフローを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、神経精神疾患治療薬プログラムにおけるメカニズムの曖昧さを低減する。
- 運用的価値： 分子介入に関連する行動表現型解析を標準化し、再現性と拡張性を確保する。
- 戦略的価値： 疾患に関連する行動における受容体複合体の必要性を明確にすることで、go/no-go判断に寄与する。
- ポートフォリオへの影響： CNSパイプラインの推進に向けて、リスク調整に基づいたターゲットおよびメカニズムの優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 齧歯類における定位手術および行動表現型解析の専門知識が必要です。
- ウイルスベクター作製および分子生物学的検証（免疫細胞化学染色、ウェスタンブロッティング）のためのインフラへのアクセスが必要です。
- 注入のタイミング、行動試験、およびデータ解析について、チーム間での厳格な標準化が必要です。
- 他の受容体複合体や行動アッセイに適応させる場合は、プロトコルの最適化が必要になる場合があります。
- データの整合性を維持するためには、ウイルス導入、行動評価、および組織採取の間の正確なタイミングが極めて重要です。
