2016年2月16日
我々は、分離、表現型の特徴およびマウス歯肉からの免疫細胞の機能解析のための手法を確立しました。
この方法の全体的な目標は、口腔免疫および歯周炎に関連する免疫応答の詳細な特性評価のために、歯肉免疫細胞を単離することです。この方法は、歯周炎の病因にどのような細胞因子が関与しているかなど、経口免疫の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、経口免疫細胞ネットワークの評価と、下流のinvitro研究に十分な生存細胞の単離を可能にすることです。
このプロトコルの最初のステップとして、マウスの体を固定し、胸腔と腹腔を開いて心臓と内臓を露出させるためのピンを配置することから始めます。次に、大静脈を切開し、27ゲージの針を備えた3ミリリットルの注射器を使用して、左心室を介して3ミリリットルのPBSを大量に投与します。すべての血液が洗い流されたら、胃を上に向けてマウスの頭を解剖パッドに固定します。
次に、ハサミを使用して唇の各交連を首に向かって切り、下顎骨と首の領域を覆う皮膚を分離し、下にある組織と筋肉を露出させます。下顎の両側を分離するために、下切歯の間を切断します。分離した下顎骨の両側を25ゲージの針で固定して、口腔にアクセスします。
口蓋を特定した後、10番の外科用ブレードを使用して、第1大臼歯のすぐ前方に垂直に切開し、第3大臼歯の後部に切開します。次に、鼻腔から組織を解剖し、下顎骨からブロックを解剖します。次に、歯肉の境界から余分な組織を取り除き、上顎ブロックと下顎ブロックを、氷上に5ミリリットルのコラゲナーゼとDNaseを含む50ミリリットルの円錐管に移します。
摂氏37度のシェーカーインキュベーターで組織を1時間消化し、最後の5分間に50マイクロリットルの0.5モルEDTAを追加します。次に、5ミリリットルの冷たいDNase培地を組織に加え、チューブの内容物を渦巻かせて穏やかに混合します。次に、4つのティッシュブロックをペトリ皿に移します。
そして、それらを500マイクロリットルの新鮮なDNase培地で覆います。メスを使用して、組織の各ブロックから歯肉を取り除きます。そして、皿の全内容物を50ミリリットルのチューブの上にある70ミクロンのセルストレーナーに移します。
ペトリ皿とストレーナーを3〜5ミリリットルの新鮮なDNase培地で洗います。次に、滅菌済みの3ミリリットルシリンジのプランジャーを使用して、歯肉組織をストレーナーのメッシュに押し付けます。ストレーナーを30〜35ミリリットルの冷たいDNase培地ですすぎ、濾液を遠心分離します。
次に、口蓋を1ミリリットルの完全培地に再懸濁し、生細胞の数を決定します。今示したように、免疫細胞の単離とプロセシングにより、野生型と歯周炎にかかりやすい動物の両方から、歯肉細胞のサイトカイン分泌パターンのex-vivo刺激と特性評価を行うのに十分な数の細胞が得られます。実際、マウスの歯肉免疫細胞組成は、歯周炎に罹患しやすいLFAノックアウトマウスのt細胞およびナチュラルキラー細胞コンパートメントを評価するこれらの密度プロットで示されているように分析できます。
適切なゲーティング戦略を用いることで、TCRβCD4陽性、TCRβCD8陽性、TCRγδ陽性t細胞、NK細胞、自然リンパ球の細胞内サイトカイン産生も決定できます。習得した細胞は、技術が適切に実行されれば、免疫染色のために3時間で単離できます。この手順を試みる際には、すべてのステップを効率的かつ迅速に完了し、細胞が操作されていないときは常に氷上に保つことを覚えておくことが重要です。
この手順に続いて、セルソーティングなどの他の方法を実行して、特定のセルサブセットの機能に関連する追加の質問に答えることができます。
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本記事では、マウスの歯肉から免疫細胞を単離および特性解析するための手法を紹介します。この手法は、口腔免疫および歯周炎に関する理解を深めることを目的としています。
歯肉免疫細胞の精密な単離と機能プロファイリングは、口腔免疫学におけるメカニズムのデリスキングを可能にし、炎症性疾患研究におけるターゲット検証をサポートします。このワークフローは、定量的表現型解析およびex vivo機能アッセイに供するための生存率の高い細胞集団を提供し、初期探索およびトランスレーショナル研究における予測の信頼性を高めます。本手法は、組織常在性免疫ネットワークの堅牢な解析を可能にすることで、免疫学および口腔健康R&Dにおけるポートフォリオ決定に寄与することを目的としています。
本手法は、口腔疾患モデルにおけるメカニズム研究および機能的スクリーニングの両方に向けて高品質な免疫細胞調製物を提供することで、発見から前臨床までの連続的なプロセスへと統合されます。