イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

この実験プロトコルの全体的な目標は、ゼブラフィッシュの胚の眼の発達をライトシート顕微鏡で画像化し、取得したマルチビューデータセットをFigiでマルチビュー再構成アプリケーションプラグインを介して処理することです。この方法は、動物の発生における形態形成イベントを理解するのに役立ちます。この方法の主な利点は、タクト胚の発生における形態形成イベントを高い空間的および時間的分解能で観察できることです。

ライトシート顕微鏡法の主な利点は、この方法の光毒性が低いこと、サンプルをイメージングできる取得タイミングが速いこと、およびサンプルをさまざまな角度からイメージングできること、いわゆるビューイングできることです。さまざまなビューからサンプルをキャプチャすることで、信号と設定された軸の劣化を克服することができます。これらの異なる画像は、サンプルの周りの蛍光マイクロスフィアを使用して使用および登録できます。

等方性分解能に達する3次元体積を再構築できます。私たちは、ゼブラフィッシュの眼の発達に光シート蛍光顕微鏡を用いることを実証していますが、この方法は、様々なモデル生物を用いて、発生生物学や神経科学における様々な疑問に答えるためにも利用することができます。まず、照明対物レンズを覆ったまま、検出対物レンズを顕微鏡にねじ込みます。

次に、対物レンズのキャップを外し、サンプルチャンバーを顕微鏡に慎重にスライドさせます。ネジを締めてチャンバーを固定します。次に、温度プローブとペルチェブロックを顕微鏡に接続します。

ペルチェブロックの冷却液を循環させる2本のチューブは、両方のコネクタと互換性があり、どちらの向きでも機能します。次に、シリンジを使用して、チャンバー窓の上端まで溶液をシリンジに通し、漏れがないか確認します。次に、顕微鏡、コンピューター、およびインキュベーションのスイッチを入れます。

顕微鏡操作ソフトを起動し、インキュベーション温度を28.5°Cに設定します。温度が1時間必要である間に、サンプルを準備します。アガロースの準備から始めます。

調製した1ミリリットルのアリコートを1%低融点アガロースでE 3中毒で摂氏70度で溶かします。約15分後、600マイクロリットルの溶融アガロースを新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移し、250マイクロリットルのE three培地、50マイクロリットルの0.4%MS 222、および25マイクロリットルのボルテックス蛍光ビーズストック溶液を追加します。チューブを摂氏約39度の加熱ブロックに入れて、アガロースをゲル化点に近づけます。

次に、テフロンチップのプランジャーを内径1mmのガラスキャピラリーの底まで押し下げます。このうち5つを用意します。次に、アガロース混合物を短時間ボルテックスし、最小限の液体で5つの胚をその中に移します。

次に、毛細血管を挿入し、最初に1つの胚の頭を吸引します。ヘッドはテールの前に入らなければならず、気泡があってはなりません。胚の上に約2センチメートルのアガロースがあり、その下に1センチメートルのアガロースがあるように、十分な溶液を描きます。

進行する前に、各毛細血管に1つの胚を描きます。このステップをマスターするには、ある程度の練習が必要です。価値のない胚を使用して準備します。

アガロースが完全に固まったら、底部を溶液中で粘土でビーカー壁に毛細血管を支え、サンプルをE 3媒体に保管します。次に、サンプルホルダーを組み立てます。まず、適切なサイズの2つのプラスチックスリーブを互いに押し合わせてステムに挿入します。

袖のスリットは外側を向いている必要があります。次にクランプネジを取り付けます。そして、反対側に黒い色のバンドが見えるまで、キャピラリーをホルダーに挿入します。

プランジャーには触れないでください。次に、clを締めますamp ネジ。次に、キャピラリーから1センチメートルのアガロースを押し出し、トリミングします。

次に、ステムをサンプルホルダーディスクに挿入します。サンプルディスクをロードする前に、制御ソフトウェアのステージが一番上の位置にあることを確認してください。次に、ガイドレールを使用してホルダーをスライドさせ、サンプルを顕微鏡に滑り込ませます。

次に、選択したサンプルをテキストプロトコルで説明されているように画像化します。データ処理はFigiで行われます。ImageJのディストリビューションです。

始める前に、Figi を更新する必要があります。取得した画像データセットを1つのフォルダに保存します。画像処理の中間ファイルは同じフォルダに保存されます。

次に、マルチビュー再構築アプリケーションを起動します。次に、新しいデータ・セットを定義します。「Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats」オプションを選択し、出力データファイルの名前を作成します。

次に、データ・セットの最初の CZI ファイルを選択します。メタデータは自動的にロードされます。画像のメタデータで、角度の数、チャネル、イルミネーション、ボクセルサイズがすべて正しく設定されていることを再確認してください。

[OK] を押すと、ログ ウィンドウ、ビュー設定エクスプローラー ウィンドウ、およびコンソール ウィンドウが開きます。ビュー設定エクスプローラーは、ユーザーフレンドリーなインターフェースを提供します。処理が必要なファイルを選択し、マウスの右ボタンを押します。

新しいウィンドウが開き、さまざまな処理ステップが実行される様子が表示されます。右上隅には、情報ボタンと保存ボタンがあります。情報には、保存されたデータファイルの内容の概要が表示され、保存を押すと処理結果が保存されます。

それ以外の場合、プログラムは処理ステップの結果を保存しません。データセット全体を再保存するには、まず、Ctrl+A を押して右クリックし、すべてのファイルを選択します。次に、 [Resave Dataset](データセットを再保存) と [As HDF5](HDF5 として) を選択します。

その後、再保管アクションの確認をオフにする必要があります。数分後、各時点について、プログラムは再保存が完了したことを示します。次に、データ内の関心ポイントの検出に進みます。

Ctrl+A を押して右クリックし、すべてのタイムポイントを選択します。選択するには、関心ポイントを検出します。オプションから、ガウス差を選択します。

そして、セグメンテーションの前にサンプル画像を選択します。次のウィンドウで、検出設定を選択します。サブピクセル位置推定オプションから、[3 次元 2 次近似] を選択します。

次に、関心ポイントの指定で [インタラクティブ] を選択します。ダウンサンプルのXYオプションとして、Z解像度に一致を選択します。そして、ダウンサンプルZの場合は、1xを選択します。

次に、CPU Java オプションで計算を選択して操作を実行します。ポップアップウィンドウから、パラメータをテストするためのビューを1つ選択します。ビューが読み込まれたら、キーボードのCtrl + Shift + Cを押して明るさとコントラストを調整します。

また、ビード検出の場合は、ルック・フォー・マキシマ・グリーン・オプションを切り替えます。次に、検出の周囲に緑色のリングとしてセグメンテーションを観察します。シグマ 1 パラメーターとしきい値パラメーターのガウシエン差値を調整して、誤検出の数が最小限になるようにビーズを最適にセグメント化します。

各ビーズは一度だけ検出する必要があります。最適なパラメータを決定したら、完了を押します。コンピュータがロードされた後、各時点の個々のビューとビーズのセグメント化、プログラムは、ビューごとに検出されたビーズの数を含むログファイルを出力します。

ビューごとに600〜数千個のビーズが必要です。それ以外の場合は、検出パラメータを調整する必要があります。これは難しいプロセスです。

検出ピラミッドが最初の試行で正確になることはめったになく、リセットは 1 つの映画の時点間で異なる可能性があります。新鮮なものをリラックスさせると、すべての本物のビーズが検出され、より多くの誤検知が可能になります。ピラミッドの組み合わせが機能しない場合は、異なる蛍光ビーズを使用して新しいデータセットを取得する必要があります。

次に、検出の登録とスタックからのマルチビューデコンボリューションの作成に進みます。LSFMは、細胞間構造から細胞、組織全体まで、複数のスケールで発生過程を長期間イメージングするのに理想的な方法です。神経前駆細胞の微小管の成長など、非常に高速な細胞間イベントを高解像度で捉えることができます。

シングルビュー動画から、微小管の成長を定量化することができます。細胞内構造は、網膜神経節細胞内の中心体など、何時間も追跡できます。単一細胞の挙動は、網膜を横切る神経節細胞のトランス位置など、組織全体の画像から抽出できます。

マルチビューデコンボリューションは、点像分布関数を使用して複数の異なるビューを組み合わせることにより、1つの等方性Zスタックを作成します。これにより、シングルビューや加重平均フュージョンと比較して、画像が大幅に改善されます。例えば、視小胞の光学カップへの変換は、示されているデータセットを通じて、異なる向きの光学スライスから研究することができます。

さらに、胚の奥深くまで全体的に良好な画質が明らかです。例えば、オプティックカップの形態形成を見るときなど。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの胚をライトシート顕微鏡に画像マウントする方法を十分に理解できるはずです。

そして、Figiでマルチビューデータセットを処理する方法。マスターすると、ライトシート顕微鏡でのタイムラプス実験を開始するのに約2時間かかります。その後のデータ分析には、かなり時間がかかります。

そのタスクには、コンピューター クラスターを使用すると便利な場合があります。より実用的なヒント、トラブルシューティングのアドバイス、およびその他のリソースへのリンクは、テキストプロトコルにあります。実験に先立って、十分なストレージ容量と明確なデータ処理パイププランが利用可能でなければなりません。

問題、質問、または今後のリクエストがある場合は、それぞれの機能Webサイトを参照するか、それぞれのgithubリポジトリの問題を提出してください。