初期の飢餓応答でCoronin Aの機能を調査細胞性粘菌凝集アッセイによって

この実験手順の全体的な目標は、Dictyostelium discoideumのCoronin-A依存性早期飢餓反応を調査することです。この方法は、Dictyostelium discoideumの初期発生に関与するシグナル伝達経路や因子の同定など、発生生物学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、初期発生シグナル伝達に関与する発生誘導因子およびタンパク質の自動化されたハイスループットスクリーニングのためのツールを提供できる可能性があることです。

一般に、この方法を初めて使用する人は、細胞密度、付着時間、発生時間など、アッセイに固有の複数の変数のために苦労します。この手順を開始するには、HL-5培地を含む三角フラスコで、摂氏22度、160rpmの振とうインキュベーターでDH1.10細胞またはcorA欠損細胞を増殖させます。細胞を1ミリリットルあたり10の1倍から4倍、および10の2倍から6個の細胞の密度に保ちます。

細胞凝集を調べるには、10〜50ミリリットルの対数期増殖DH1.10細胞またはDH1.10バックグラウンドで生成されたcorA欠損細胞を回収します。それらを400倍gで3分間遠心分離します。次に、BSSで細胞を2回使用しました。

その後、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。続いて、細胞を24ウェルプレートに播種します。BSSで摂氏22度で1時間接着します。

その後、タイムラプス顕微鏡で細胞凝集を可視化し、135秒ごとに画像を撮影します。DH1.10細胞またはDH1.10 corA欠損細胞の発生に対する外部適用サイクリックAMPパルスの影響を調べるには、10〜50ミリリットルの細胞を回収し、400 gで3分間遠心分離します。その後、BSSで2回洗います。

血球計算盤を使用して細胞をカウントします。続いて、BSS中の1ミリリットルあたり7個の細胞に対して10の1倍の密度で細胞を再懸濁します。次に、パルスを適用する前に、22°Cで160rpmで2時間培養物を振とうします。

次に、タイマー制御の蠕動ポンプを使用してサイクリックAMPパルスを印加します。5時間にわたって6分半ごとにサイクリックAMPの5秒間のパルスを供給するようにポンプをプログラムします。重要なステップは、サイクリックAMPインジェクションの先端が溶液に連続的に沈むのではなく、シェーカーによって生成される波に定期的に沈むだけであることを確認することです。

サイクリックAMPの適用後、血球計算盤を使用して細胞を再度カウントします。次に、細胞を24ウェルプレートに播種し、BSSで1時間接着させます。16時間後、5 x 主観的を用いた明視野顕微鏡で、摂氏 22 度での細胞凝集を視覚化します。

この手順では、HL5培地で摂氏22度で振とう培養した培養物から対数期DH1.10細胞またはDH1.10 corA欠損細胞を採取することにより、新鮮な馴染剤を調製します。細胞を400 gで3分間遠心分離します。その後、PBMで3回洗います。

続いて、血球計算盤を使用して細胞をカウントし、次に、10の10倍1ミリリットルあたり7個の細胞の密度でPBMに再懸濁し、110rpmで摂氏22度で20時間振とうします。次に、細胞を400倍gで3分間遠心分離し、続いてコンディショニング培地を回収します。その後、4°Cで15分間、gの8,000倍で遠心分離することにより、培地を清澄化します。

次に、0.45マイクロメートルのフィルターで馴染ませた培地をろ過し、PBMで3倍に希釈します。血球計算盤を使用して細胞をカウントし、24ウェルプレートにプレートし、摂氏22度で1時間接着させます。次に、細胞の上清を予め調製した馴化培地と交換します。

16時間後、5倍主観を使用して明視野顕微鏡で細胞凝集を視覚化します。ここで、Coronin-Aを欠損した細胞は、発生初期に欠陥を示し、Dictyostelium discoideumの発生サイクルの最初のステップである多細胞凝集体を形成することができませんでした。この図では、栄養型の野生型とcorA欠損細胞を2時間洗浄して飢餓状態にした後、15匹の動物またはサイクリックAMPを6分半ごとに5時間懸濁させてパルス化しました。

外因性サイクリックAMPパルスの適用により、野生型の表現型が完全に復元されました。この図では、指数関数的に増殖する野生型およびcorA欠損細胞をPBMで洗浄し、マルチウェルプレートに播種し、野生型またはcorA欠損細胞から得られた馴化培地でインキュベートしました。画像は、細胞を播種してから16時間後に撮影されました。

corA欠損Dictyostelium discoideumは、発生誘導に必要なすべての因子を生成することができましたが、それらに応答することはできませんでした。一度習得すると、この技術は、適切に実行されれば、インキュベーション時間を含めて20時間で行うことができます。この手順を試みる際には、異なる株に対して、細胞密度、付着時間、発生時間など、アッセイの複数の変数の調整が必要になることを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、Dictyostelium discoideumの早期飢餓応答に関与する因子を特定するために、生化学的分画およびその後のプロテオミクス分析を実施することができます。このビデオを見た後、いずれかの条件付けされた媒体とサイクリックAMPパルスを使用して、水没条件下でDictyostelium discoideumの初期発生を誘導する方法を十分に理解しているはずです。