心筋細胞のDNA合成と倍数性の同時評価：心筋細胞再生の定量化を支援する方法および売上高

本プロトコルの全体的な目的は、長期的なヌクレオシド標識とフローサイトメトリーを用いて、核のポリプロイド化（多倍体化）を考慮しつつ、新生心筋細胞核を定量化することで、心筋細胞のターンオーバーを定量することです。この手法は、心筋細胞再生の分野における重要な課題に取り組むために利用でき、また、心筋細胞生成のダイナミクスの変化を定量化するためのスクリーニングツールとして活用できます。本プロトコルの主な利点は、細胞源にかかわらず、ポリプロイド化を制御しながら、新生心筋細胞の生成を感度良く正確に定量化できる点にあります。

6回目のEdU投与から24時間後、処置した動物を仰向けに配置し、手術用ハサミを用いて腹部中央から横隔膜にかけて皮膚を切開します。次に、胸骨を体腔から両側に広げながら横隔膜を切断し、心臓を露出させます。その後、心臓を軽く持ち上げ、流出口の主要血管を切断して、心臓を胸腔から摘出します。

採取後すぐに、4°Cに冷却した10 mLのPBSを含む個別の15 mL遠心チューブに心臓を入れます。次に、サンプルを個別の10 cmシャーレに移し、メスを用いて各心臓を正中矢状面に沿って2等分に切断します。続いて、ピンセットで心臓の断片を軽く圧迫します。

心臓の2つの断片を取り出し、20 mLの新鮮なPBSが入ったペトリ皿に入れます。新しいペトリ皿と20 mLの新鮮なPBSを用いて、もう一度この操作を繰り返します。心臓の両方の部位を同じ1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、25ゲージの針を用いて各チューブの蓋に小さな穴を開けます。これは、心臓の処理時に蓋が開くのを防ぐためです。

次に、各チューブにラベルを貼り、心臓組織を液体窒素容器内で凍結させます。分析する心臓1つにつき、1% BSAおよびPBSを36 mL、超遠心管に入れます。30分後にこの溶液を廃棄します。

チューブが風乾したら、各チューブに10 mLのスクロース密度勾配溶液を加えます。液体窒素で凍結した心臓サンプルをメスで個別に細切し、各心臓から得られた組織片を、15 mLの細胞溶解バッファーを含む個別の50 mLコニカルチューブに移します。プローブ型ホモジナイザーを用い、室温にて25,000 rpmで15秒間、サンプルをホモジナイズします。

次に、各チューブに溶解バッファーをさらに15 mL加え、サンプルを1つずつ、クリアランスの大きいペッスルを備えた40 mLのダウンスホモジナイザーに移します。ペッスルで10回ストロークし、細胞スラリーを100 µmのストレーナー、次いで40 µmのセルストレーナーでろ過し、個別の50 mL遠心チューブに回収します。その後、遠心分離により心核ペレットを回収し、細胞をそれぞれ25 mLのスクロース密度勾配溶液に再懸濁します。

準備した超遠心管に、核を含まないスクロース密度勾配の上に細胞を積層し、スイングアウトローターを用いて遠心分離します。遠心分離後、核ペレットを1,300 µLの核保存バッファーで再懸濁し、PCM1とラベルした1.5 mLマイクロ遠心管に移します。PCM1チューブの懸濁液から各300 µLを新しいマイクロ遠心管に移し、700 µLの新鮮な核保存バッファーを加えて、ISO controlとラベルします。

次に、PCM1核をanti-PCM1抗体で、ISOコントロール核をrapid IGG isotype control抗体で、4°Cで一晩ラベルします。翌日、サンプルを遠心分離し、ペレットを1 mLの新鮮な核保存バッファーに再懸濁して、同じ条件下で2回目の遠心分離を行います。2回目の遠心分離後、ペレットを1 mLの新鮮な核保存バッファーに再懸濁し、1 µLのfitzy結合 goat anti rabbit IgG F(ab'2)フラグメントとともに、4°Cの暗所にて1時間インキュベートします。

EdUの取り込み度合いを評価するため、PCM1およびISOコントロールでラベル付けした核懸濁液を遠心分離し、1%BSA含有PBS 1 mLで2回連続で洗浄してペレットを再懸濁します。2回目の洗浄後、上清を100 µLのEdU固定液に交換し、室温・暗所にて15分間サンプルをインキュベートします。固定終了後、核を1 mLのPBS BSAでさらに2回洗浄し、その後100 µLのサポニンベースの透過化溶液を用いて室温でサンプルをインキュベートします。

15分後、新鮮に調製したEdU標識カクテルを各チューブに500 µL加え、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション終了後、サンプルを3回遠心分離し、2回目と3回目の遠心時に1 mLのPBS BSAで核を洗浄します。最後に、400 µLのDNA染色液でサンプルを標識します。

パルス刺激した心臓の免疫組織学的解析により、EdUを取り込んだPCM1発現心筋細胞の存在が示されます。しかし、免疫組織学的な手法で得られたデータは、EdUを取り込んだ他の細胞型が心筋細胞と誤認される可能性があるため、誤解を招く恐れがあります。mdxマウスおよび対照マウスを用いた研究において、本プロトコルで詳述するフローサイトメトリー解析により、脱ポリプロイド化のためにEdUを取り込んだ細胞を除外しながら、新生心筋細胞核の生成を迅速に定量することが可能になります。

以前に公表されたデータと同様に、この代表的な実験において、年齢を一致させた対照群と比較して、mdxマウスの心臓における新生心筋細胞核の生成率の上昇が観察されました。この手法に習熟すれば、2日間にわたって合計4時間で完了させることができます。この手順を実施する際は、解析時にゲートを正確に設定できるよう、EdUおよびPCM1の両方のネガティブコントロールを必ず準備することが重要です。

この手法は、多くの追加的なダウンストリーム免疫組織学的手法とも併用可能であり、さまざまな心臓細胞型における核細胞の取り込みを定量化することができます。この手法は心血管研究の分野において、非虚血性心筋症のmdxモデルにおける心筋細胞再生の変化を研究するために用いられてきました。このビデオを視聴することで、新生心筋細胞核を迅速に定量化する方法や、心筋細胞の再生およびターンオーバーの変化をスクリーニングするために倍数化のカウントを観察する方法について、十分に理解できるはずです。