鏡の国のアリス：単一細胞のタイムラプス顕微鏡と縦トラッキング抗がん治療薬を研究します
2016年5月14日
ここでは、抗がん治療薬に応答して単一細胞を縦断的に追跡する長期のタイムラプス顕微鏡法について説明します。
この手順の全体的な目標は、培養中の単一細胞における抗がん治療応答を観察することです。この方法は、不均一な治療応答や細胞運命など、がん研究分野の重要な質問に答えることができます。まず、認定された滅菌層流フードの下で、テキストプロトコルに従って培養認定された皿でHT1080細胞を調製し、加湿細胞培養インキュベーターで細胞をインキュベートします。
イメージングの2日前に、ウェルあたり50,000個のHT1080 FuGENE細胞を、12ウェル、No.1.5ガラス底皿の所望のウェル数にプレートします。増殖速度や使用するディッシュに応じて、プレーティングする細胞の数を調整し、実験開始時に約60%のコンフルエントを達成します。
環境チャンバーを湿度約80%に設定し、サンプル位置の温度を摂氏37度に設定します。メーカーの指示に従って、貯水池が滅菌蒸留水で満たされていることを確認してください。次に、環境チャンバーを希望の温度設定にオンにし、顕微鏡ステージに配置してセットします。
ステージトップチャンバーとステージインセットの間に空きスペースがある場合は、チャンバーを挿入する前に、ステージインセット開口部の端にパラフィンフィルムを敷き詰めて、チャンバーをステージに結合します。チャンバーを引っ張る接続部が引っ張られていないことを確認してください。これは、どちらもモーションアーチファクトを引き起こす可能性があります。ダミーの皿に水を入れてチャンバーに挿入し、チャンバーを摂氏37度まで平衡させてから、安定した温度を維持します。
イメージングのセットアップを行うには、顕微鏡、コンピューター、および必要な周辺機器の電源を入れます。光源によっては、必要になるまで電源を入れるのを待ちます。対物レンズタレットを低い位置に置いた状態で、20x0.7開口数対物レンズを選択します。
次に、サンプルを対物レンズの上に置くと、サンプルがチャンバー内にあるときに細胞を見つけやすくなります。画像化する細胞を環境チャンバーに移した後、テキストプロトコルに従って、安定した環境を維持し、大気ガスをオンにするためにチャンバーを密閉します。次に、露光時間を制限し、低強度の光を使用することで、光の毒性を防ぐイメージング条件を選択します。
X、Y、Z平面と、画像化する各位置の目的の波長を見つけます。ほとんどの細胞プロセスの長期的なタイムラプスでは、10〜20分ごとに1つの画像を取得します。時間分解能が高いほど、より多くのデータポイントとより堅牢な細胞追跡が得られますが、より統合された光の露光とより大きなデータセットが得られます。
HT1080 FuGENEはダイナミックな緑色と赤色の求光タンパク質を有するため、以下の露光時間を使用し、2×2ビンを使用してください。詳細設定で、デフォルト設定を使用してソフトウェア制御のオートフォーカスを有効にします。10 マイクロメートルのオートフォーカス範囲を、推奨されるステップ サイズで定義します。
実験皿では、熱ドリフトを減らすために、培地の半分を、摂氏37度に温めた目的の薬剤を含む培地と交換します。最後に、タイムラプスを開始し、テキストプロトコルに従って画像を取得します。これらの動画は、p53の状態のみが異なる乳がん由来のMCF7細胞株を、キネシン-5を阻害する抗がん剤で治療し、有糸分裂停止を引き起こした一対の例を示しています。
この図に見られるように、安定なp53ノックダウンによってp53が除去されると、細胞が有糸分裂を離れた後に停止するのではなく、細胞が停止するのではなく2回目の有糸分裂に入るというサイクルが繰り返され、分裂せずに有糸分裂を離れます。ここに示されているのは、mCherryに融合したクロマチンマーカーHistone 2bとEGFPに融合したβチューブリンを安定して発現する子宮頸がん由来のHela細胞です。微小管安定化薬であるパクリタキソールで治療すると、有糸分裂時に染色体の整列と分配が乱され、DNA損傷を受けやすい核の膨らみと小核が形成されます。
この細胞株は、CDT1の2つの求光ユビキチン細胞周期インジケーター(オレンジ色)とジェミニン(緑色)を安定して共発現し、細胞周期を正常に進行します。同じ細胞をCDK46阻害剤で処理すると、細胞はG2期を経て正常に分裂し、その後G1期で強く停止し、成長中の腫瘍における感情的な細胞増殖抑制効果の可能性を示しています。この手法の主な利点は、単一細胞の応答を推測するのではなく、何日にもわたってリアルタイムで直接追跡できることです。
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概要
本記事では、抗がん剤治療に対する単一細胞の応答を追跡するための、長期タイムラプス顕微鏡観察法について解説します。この技術により、研究者は不均一な治療応答と細胞の運命をリアルタイムで観察することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- がん研究
背景
- 抗がん剤に対する細胞の応答を理解することは、がん治療において極めて重要です。
- シングルセル解析により、細胞の不均一性に関する知見が得られます。
- タイムラプス顕微鏡観察により、動的な細胞プロセスの観察が可能です。
- HT1080およびHeLa細胞株は、がん研究において一般的に使用されています。
研究目的
- 抗がん剤が個々の細胞に及ぼす影響を観察すること。
- 治療反応に差が出るメカニズムを調査すること。
- 細胞挙動を長期的にイメージングする方法を提供すること。
使用した手法
- 培養皿におけるHT1080細胞の調製。
- 安定したイメージング条件のための環境チャンバーの設置。
- タイムラプス顕微鏡を用いて、細胞応答を時間経過とともにキャプチャする。
- 蛍光マーカーを用いて細胞プロセスを可視化する。
主な結果
- p53をノックダウンした細胞は、異常な有糸分裂挙動を示した。
- パクリタキセル処理により、HeLa細胞における染色体の整列が乱された。
- CDK46阻害剤による処理は、細胞静止効果を持つ可能性を示した。
- リアルタイム追跡により、単一細胞レベルの応答に関する知見が得られた。
結論
- 本手法により、薬剤に対する単一細胞レベルの応答を詳細に観察することが可能です。
- リアルタイムイメージングにより、がん細胞の挙動に関する重要な知見を得ることができます。
- このアプローチは、治療効果および耐性に関する理解を深めるのに役立ちます。
よくある質問
業界における重要性
縦断的なシングルセル・トラッキングは、集団ベースのアッセイでは隠れてしまう不均一な治療反応を明らかにすることで、腫瘍学における薬剤開発の決定的なギャップを埋めるものです。この能力により、細胞運命の決定、パスウェイのダイナミクス、および耐性メカニズムを長期間にわたって直接観察することが可能となり、ターゲットのバリデーションやリード化合物の同定における予測の信頼性が向上します。本手法は、メカニズムに基づくリスク低減（de-risking）と、探索から前臨床段階に至るトランスレーショナルな連続性をサポートし、ポートフォリオの選別やリスク調整後の推進決定に寄与します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 同一遺伝子細胞モデルにおいて、抗がん剤に対する不均一な応答を直接観察することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値： リアルタイムのバイオセンサー読み取りにより、有糸分裂停止、G1期停止、またはDNA損傷誘導などの経路特異的な影響を明確にする。
- トランスレーショナル価値： 蛍光レポーターのダイナミクス（例：細胞周期、アポトーシス）を機能的アウトカムに結びつけることで、バイオマーカーの整合性をサポートする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況： 化合物スクリーニングに向け、増殖、細胞周期の進行、および細胞内局在に関する標準化された定量的な時系列データを生成します。
- 再現性： 環境チャンバーの安定化によりドリフトやアーティファクトが最小限に抑えられ、繰り返し試行間での一貫した縦断的測定が可能になります。
- 拡張性： マルチウェル形式および自動フォーカス制御に対応しており、中スループットの表現型スクリーニングキャンペーンをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性： 定義された遺伝的摂動を伴うHT1080（線維肉腫）およびHeLa（子宮頸癌）細胞株を用い、ヒト癌のコンテキストをモデル化する。
- メカニズムによるリスク低減： 細胞増殖停止効果と細胞毒性効果を区別し、耐性メカニズムとしての異常な細胞周期への再進入を特定する。
- 前臨床における連続性： ターゲット結合表現型から、生理学的に関連のある時間枠内での機能的な細胞運命の結果への橋渡しを提供する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットの検証からリード最適化に至る創薬プロセスの連続性に適合し、動的な表現型リードアウトによって構造活性相関および選択性プロファイルの情報が得られます。
- 探索生物学： 薬物曝露と、増殖、染色体ダイナミクス、およびアポトーシスシグナリングのリアルタイムな変化を関連付けることで、標的仮説を検証します。
- スクリーニング： 不均一な細胞集団に対する化合物の影響を評価するのに適した、高コンテンツで時間分解能の高いアウトプットを提供します。
- アナリティクス： 化合物の比較ランキングを裏付けるキネティックパラメータ（例：停止期間、再進入頻度）の抽出を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： パスウェイ特異的なレポーターを通じて、in vitroの表現型を、奏効および耐性の臨床バイオマーカーへと結びつけます。
- エンタープライズでの再利用： 腫瘍学の適応症や標的クラス全般に適用可能な、再利用可能なイメージングプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：エンドポイントアッセイでは検出不可能な、一過性の、稀な、あるいは遅延した反応を解明することで、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値：制御された条件下での長期的なライブセルイメージングを標準化し、チーム間でのデータの一貫性を向上させる。
- 戦略的価値：有糸分裂スリッページや適応性耐性などの責任メカニズムを早期に明らかにすることで、go/no-go判定を改善する。
- ポートフォリオへの影響：単一細胞の応答プロファイルと効果の持続性に基づいた、化合物のリスクベースの優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 生細胞イメージング、環境制御、および蛍光バイオセンサーのバリデーションに関する専門知識が必要です。
- ステージトップインキュベーションシステム、ドリフト補正ハードウェア、および高感度カメラに依存します。
- チャンバーの平衡化、培地交換、およびフォーカス維持のための標準作業手順書（SOP）が必要です。
- 適応上の考慮事項には、光毒性の管理、バイオセンサーのスペクトルの重なり、および細胞株特有の播種密度が含まれます。
- 実用上の制限として、長期的なマルチパラメーター追跡におけるデータストレージの需要と解析の複雑さが挙げられます。
