皮膚外科神経切除：皮膚病のマウスモデルにおける神経のための要件をテストする方法

この手順の全体的な目的は、正常および病理学的な皮膚に対する神経の影響を調べることです。この手法は、皮膚神経が恒常性と疾患に影響を与えるかなど、正常な皮膚生物学における重要な疑問を解決するために使用できます。この技術の主な利点は、同一個体から採取した無処置の皮膚サンプルと除神経した皮膚サンプルを比較できることです。

神経は周囲の組織への損傷を最小限に抑えつつ認識し除去することが困難な場合があるため、本手法の視覚的な実演は極めて重要です。まず、マウスに麻酔を施し、足指をつねって適切な鎮静レベルに達しているかを確認します。また、マウスの呼吸と心拍が正常であることを確認してください。

次に、無菌的な手術エリアにあるウォーミングパッドの上に動物を安置します。電気バリカンを使用して、生検を行う背側の被毛を慎重に除去します。その後、Betadyneとアルコール綿を用いて、除毛した部位を拭き取ります。

採取部位からすべての切毛を取り除いてください。次に、黒色のマーカーを用いて生検部位の輪郭を描きます。毛包の縦断切片を得るため、生検部位の長辺を、背正中線に平行に前方から後方に向かう方向となるように配置してください。

メスを用いて、下層の筋膜を損傷しないように全層切除を行います。通常、出血は最小限です。生検サンプルには、表皮、真皮、皮下脂肪、および肉様盤を含める必要があります。

切り出した皮膚サンプルを、真皮側を下にして乾いたペーパータオルの上に平らに広げます。余分なペーパータオルを切り取り、他のサンプルを回収する必要がある場合は、冷やしたTBS中で最大1時間まで保存します。マウスに戻り、生検部位を60ナイロン縫合糸を用いて約3 mm間隔で縫合します。

その後、マウスが意識を取り戻すまで回復ケージ内で観察します。施設で指定された動物愛護規定に従って鎮痛剤を使用し、マウスに苦痛が見られる場合はそのガイドラインに従ってください。手術から7〜10日以内に、縫合糸を抜去します。

組織学的な解析またはホールマウント染色のために、生検サンプルの処理を進めます。動物を麻酔し、背面の皮膚全体を剃毛し、生検の手順と同様に患部を洗浄します。次に、滅菌メスを用いて、首の付け根から尾の約0.5 cm上まで、背面の正中線に沿って切開します。

滅菌済みの鈍端鉗子を用いて、左側の皮膚を脇腹からゆっくりと剥離し、頸部付近の肩甲骨脂肪パッドから後肢の直上までの下層組織を可視化します。次に、解剖用実体顕微鏡下で背側皮神経を同定します。これらは白い線維状に見え、体壁の半透明な筋膜を尾側に向かって走行した後、急激に屈曲して皮膚下の疎性結合組織に入ります。

次に、超極細ピンセットを用いて、T3からT12の解剖学的部位にある動物の左側の神経のみを除去します。体壁で分節が屈曲している箇所から皮膚への進入部位にかけて、神経を引き抜いてください。ピンセットを垂直に構え、屈曲部位から約0.5 cm下の神経を把持します。把持した後、上方へ引き上げることで神経を伸展させ、周囲の組織から分離させて除去します。

隣接する血管を損傷しないように注意してください。0.9%生理食塩水を定期的に滴下し、処置の間ずっと組織を湿らせておいてください。体壁から皮膚に伸びるすべての神経を除去し続けますが、体壁の密な筋膜内にある神経は切除しないでください。

次に、露出した皮膚フラップから神経を除去します。これらの繊維は背側皮神経の末梢枝であり、皮膚フラップの真皮側の結合組織内に散在する白い分岐した線状の構造として現れます。これらの細い枝を除去するには、ピンセットを真皮表面におよそ平行に配置し、神経を掴んで上に引き抜きます。

このようにして、視認できるすべての神経を除去します。血管や皮膚を穿刺しないでください。この工程では、隣接する血管を破裂させないようにすることが重要です。

隣接する血管がある神経が見つかった場合は、血管が隣接していない領域までその神経を辿り、つまみ出すようにして除去します。次に、背側正中切開部の右側の皮膚を緩めますが、神経は除去しないでください。これを対側シャム手術対照群として使用します。

最後に、動物を縫合し、これまでと同様に術後の経過を観察します。その後、神経喪失が安定して維持されていることを確認するため、手術から数週間後に、滅菌済み皮下注射針を用いて脱神経領域を軽く刺激します。動物が反応（通常は身震いさせたり、頭を向けたりする動作）を示すかどうかを確認してください。

皮膚領域が安定して脱神経されている場合、動物はほとんど、あるいは全く反応を示しません。反応が見られない領域と、対照試料とする反対側のシャム側から皮膚生検サンプルを採取します。生検サンプルから、シャム標本と脱神経標本の間でタッチドームの数や形態に潜在的な差があるかを確認するために、複数の組織切片をサンプリングすることが重要です。

Glebe one cree ERT2マウス系統を用いることで、タッチドーム上皮など、hedgehogパスウェイ活性が高い皮膚領域においてタモキシフェン誘導性の遺伝子組換えを標的化することが可能です。これらのマウスをinduce abolaxiレポーターマウスと交配させ、タッチドーム上皮を可視化しました。Nodeは、正常なタッチドームおよびそれに随伴するメルケル細胞の両方を維持するために不可欠です。

これは、除神経後の正常なタッチドーム形態の漸次的な喪失、およびケラチン8が蓄積した細胞の消失によって実験的に証明されています。また、神経はタッチドームにおけるhedgehogシグナル伝達の促進に不可欠であり、これはsham群および除神経皮膚の両方におけるGlebe 1 cree ERE2の発現およびhome-mount beta collective sided染色によってモニタリングされています。このビデオを視聴することで、これらの神経が正常な皮膚機能に関与しているか、あるいは疾患を調節しているかを検証するための、背側皮膚神経の外科的切除方法について深く理解できるはずです。

この手法を習得すれば、動物へのストレスを最小限に抑えつつ、日常的に信頼性の高い操作を行うことができます。本手順の後、アミノ蛍光染色などの手法を用いて、皮膚から神経が完全に除去されているか、および遺伝子発現に影響が出ているかを確認することが可能です。