分化運命の空間組織を探るためのヒト多能性幹細胞のステンシルマイクロパターニング

ヒト多能性幹細胞を対象としたこのステンシルベースのマイクロパターニング法の全体的な目的は、幹細胞の分化パターンを制御する空間的な環境勾配を生成するための、シンプルで堅牢な手段を提供することです。この手法は、細胞間および細胞-マトリックス間の接着力の空間的勾配が、幹細胞の分化運命の組織化にどのように寄与するかなど、ヒト幹細胞モデルを用いた組織パターニングにおける重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の利点は、細胞が付着するための細胞接着性ECMパターンを形成するために、追加の表面修飾を必要としないことです。

これは、本手法が各細胞株に応じたさまざまなECMおよび基質の構成に適合することを意味します。マイクロパターニングの手順は習得が困難であり、ステンシルと細胞の精密かつ慎重な取り扱いが求められるため、本手法を視覚的に実演することが極めて重要です。

この手順を行う前に、PTMSステンシルを設計および作製しておく必要があります。同様に、ヒトEFC細胞を基底膜マトリックス上で培養し、手順の後半で播種できる状態で準備しておきます。まず、ディッシュに超純水で調製した70%分析グレードエタノールを700 µL分注します。

次に、PDMSステンシルを溶液の上に配置し、ディッシュをバイオセーフティキャビネットに入れて一晩乾燥させます。翌日、ステンシルの下に気泡が形成されていないことを確認します。その後、細胞をステンシル上に播種できるまで、ディッシュを保持します。

DMF12を16.7 milliliters添加して1.5x溶液とし、ヒトESC品質の基底膜マトリックスのアリコートを調製して氷上に保持します。基質を100 wattsの酸素プラズマで90秒間処理します。ディッシュはプラズマチャンバーの中に入れるまで開けないでください。また、処理後は速やかに蓋をしてください。

この処理により、基板を溶液に浸した際に気泡が生じるのを防ぐことができます。次に、あらかじめ調製した1.5x basement membrane matrix溶液を450 µL、ステンシルに滴下して覆います。その後、ディッシュをパラフィルムで密閉し、5時間インキュベートします。

次に進む前に、準備したHESCコロニーの6ウェルプレートを確認します。典型的なHESCの形態を失い、分化した細胞のコロニーを特定し、吸引して除去してください。コロニーはすべて円形で、密に詰まった上皮様形態を示し、核細胞質比が高く、明瞭な核小体を有している必要があります。

次に、播種した細胞の各ウェルを2 mLのDMF12で2回洗浄します。2回目の洗浄後、Accutaseなどの消化酵素を各ウェルに1 mL加え、プレートを37 °Cで8分間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを軽く叩いて、すべてのコロニーを基質から剥離させます。

次に、各ウェルに適用した消化酵素1 mLにつき、少なくとも4 mLの培地で各ウェルを洗浄し、細胞懸濁液を1本の15 mLコニカルチューブに回収します。室温で200 gで3分間遠心分離し、細胞ペレットを形成させます。その後、上清を吸引し、10 µMのROCK阻害剤を添加した400 µLのHESC維持培地で細胞を再懸濁します。

細胞の凝集を解消するため、穏やかに3回トリチュレーションを行います。次に、懸濁液の密度を調整します。十分に混合し、培地を用いて200 µLの1:20希釈液を作成します。

ヘモサイトメーターを用いて、希釈液中の細胞数を計測します。その後、ROCK阻害剤を含む培地を用いて、必要に応じてメインの細胞懸濁液を希釈します。次に、準備した各ステンシルに規定数の細胞を添加してください。

細胞を単層で堆積させる必要があるため、均一に広げてください。細胞を沈降させるため、ステンシルをそのまま5分間静置します。その後、ディッシュを水平に保ったまま、細胞をロードしたステンシルを慎重にインキュベーターへ移動させます。

1時間のインキュベーションを行い、細胞をステンシルに接着させます。細胞の接着後、顕微鏡下で適切に接着しているかを確認してください。ステンシルをフードに戻し、未接着の細胞を吸引して除去します。

次に、DMFに溶解した0.5%の適合性非イオン界面活性剤を2 mL、ステニルの周囲に加えます。溶液を軽く回してステニル全体を覆います。その後、オートクレーブ滅菌済みのピンセットを用いて、ディッシュからステニルをゆっくりと剥がします。

ステンシルを取り除いた後、顕微鏡下でマイクロパターン形成された細胞を確認します。非イオン性界面活性剤により、これらの細胞の乾燥が防止されます。マイクロパターン形成された細胞を、界面活性剤を添加した培地溶液中で、37 °Cで10分間インキュベートします。

10分後、溶液を吸引して除去し、2 mLの通常DMF12培地でプレートを3回洗浄します。洗浄後、ROCK阻害剤を含むHESC維持培地を2 mL添加します。再度細胞を観察し、マイクロパターンが適切に形成されているかを確認します。

その後、細胞を37°Cで一晩インキュベートします。翌日、培地を吸引し、細胞をDMF12で1回洗浄した後、添加物を加えた分化培地を2 mL加え、細胞に中内胚葉分化を誘導します。その後、結果を解析します。

レーザーカッターを用いて作製したセルステンシルにより、1000 µmの微細構造を実現しました。このステンシルは、マイクロパターニングされた貫通孔を持つ薄いステンシルシートと、細胞を保持するためのPDMSガスケットで構成されていました。このツールを用いて、中胚葉および内胚葉への分化過程におけるマイクロパターニングされたHESCsの検討を行いました。

H9-HESCコロニーの辺縁部は、コロニー内部の細胞よりもインテグリン接着が高くなっています。そのため、activan、BMP4、およびFGF2で誘導すると、これらの細胞はbrachiary T陽性の中内胚葉細胞へと分化します。このような細胞を異なる幾何学的形状の単層にパターン化したところ、幾何学的な等方性直角や凸曲率部分において、インテグリン介在性の牽引力が局所的に集中し、その結果、中内胚葉への分化が促進されました。

単一コロニー内の異なる部位におけるTの発現強度は、正方形および長方形のコロニーの鋭い角、および半円弧の凸曲面において、中内胚葉誘導の程度が実際に高かったことを示しました。これは、上述の方法を用いて、細胞接着に起因する機械的な力を調節できることを証明しています。本手順を試みる前に、使用する特定のヒト多能性幹細胞株に合わせて、マトリックスコーティング時間、および細胞の消化・接着時間を最適化することが重要です。