体細胞の再プログラミングの反応速度測定とリアルタイムの可視化
2016年7月30日
この研究で提示されたプロトコルは、フローサイトメトリー分析を使用して、正および負の多能性幹細胞マーカーの動的測定によって再プログラミングの進行をリアルタイムでモニタリングするための方法を記載しています。プロトコルは、IPSCの生成時形態、およびマーカーまたはレポーター発現のイメージングに基づく評価を含みます。
これらの手順の全体的な目標は、体細胞のリプログラミングの人工多能性幹細胞またはiPS細胞への進行を視覚化し、追跡することです。この方法は、使用する体細胞組織、適用されるリプログラミング技術、それに使用されるマトリックスと培地の組み合わせによって、リプログラミング速度論とリプログラミング効率がどのように変化するかなど、iPS細胞分野の重要な疑問に答えるために使用できます。この方法の主な利点は、細胞表面マーカーを利用して体細胞からiPS細胞への移行を観察することで、この技術を使用してリプログラミングイベントをリアルタイムで監視できることです。
形質導入後7日目に、ウェルあたり2ミリリットルのDPBSで線維芽細胞を洗浄し、各ウェルに0.5ミリリットルの37°C 05%EDTAを加えて、37°Cで3〜5分間インキュベートします。細胞が丸くなったら、ウェルごとに摂氏37度の線維芽細胞培地2ミリリットルで反応を停止し、各ウェルの底に培地を静かにピペットで移動させて細胞を取り除きます。各ウェルからの線維芽細胞を個々の15ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離によってそれらを回収します。
ペレットを2ミリリットルの新鮮な37°C線維芽細胞培地に再懸濁し、各培養条件からの細胞をカウントします。次に、10〜5番目の細胞を6ウェル組織培養プレート内の予め調製したフィーダーに依存しないコンディショニングウェルに1回播種し、形質導入した細胞を細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。翌日、各ウェルの培地を細胞アプリケーションに適した培地と交換します。
次に、プレートをイメージャーにセットし、ソフトウェアを設定して、次の14日間、6〜8時間ごとに各ウェルの連続的な全ウェル位相コントラストおよび蛍光画像をキャプチャします。リプログラミング実験の最後に、2ミリリットルの摂氏37度のDMEM / F12培地でウェルを1回洗浄します。洗浄液を廃棄し、インキュベーター内で新鮮なDMEM/F12培地に適切な一次抗体のウェルあたり1ミリリットルを注入し、摂氏37度で45分間細胞を標識します。
インキュベーションの終了時に、細胞を37°CのDMEM/F12培地で2回洗浄します。次に、洗浄液を廃棄し、37°CのDMEM/F12培地に1ミリリットルの適切な二次抗体を37°Cで30分間、37°Cで標識します。インキュベーションの終了時に、DMEM/F12培地で細胞をさらに2回洗浄します。
次に、各ウェルの洗浄液を2ミリリットルの新鮮な摂氏37度のDMEM / F12培地と交換します。皿をイメージャーに入れ、イメージングソフトウェアを開きます。イメージングシステムソフトウェアでスキャンを設定するには、まず使用するトレイの位置を選択し、スキャンするディッシュの種類を選択します。
次に、目的のウェルをスキャンするためのパターン、および目的の表面マーカーをリアルタイムで同定するための適切な蛍光チャネルであるホールウェルイメージングを選択します。次に、スキャンする実験にラベルを付け、毎日スキャンするサンプルの時点と間隔を設定します。スキャンされた一連の実験を分析するには、目的の実験を選択し、[新しい分析ジョブの起動] を選択します。
次に、イメージングに使用するチャンネルに応じて、分析のタイプに適した処理定義(PSC Phase Colony Countなど)を選択します。分析ジョブに名前を付けます。そして、分析の時間範囲と分析するウェルを選択します。
次に、分析ジョブを起動します。個々のウェルから目的のリプログラミングタイムポイントを測定するには、目的のウェルを2ミリリットルのDPBSで1回洗浄します。次に、洗浄液を1ミリリットルの予熱した摂氏37度05%トリプシン-EDTA溶液と交換します。
摂氏37度の5分後、トリプシンをウェルの底にフラッシュして細胞を単一細胞懸濁液に解離し、細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。3ミリリットルのDPBSを使用して、ウェルから残りの細胞のいずれかを洗い流し、15ミリリットルのチューブに引き込みます。さらに10ミリリットルのDPBSを細胞に加え、遠心分離によりスピンダウンします。
ペレットを1ミリリットルのDMEM/F12培地に再懸濁してカウントします。次に、細胞懸濁液を1ミリリットルあたり6個の細胞の10分の1の濃度に希釈し、チューブあたり1ミリリットルの細胞を適切な数のサンプル分注します。次に、目的の一次抗体で細胞を1ミリリットルのDMEM/F12培地に室温で30〜45分間混合しながら標識します。
インキュベーションの終了時に、細胞を37°CのDMEM/F12培地で2回洗浄します。ペレットを1ミリリットルのDPBSに再懸濁し、サンプルを個々のFACSチューブに移します。再プログラムされたプレートのフローサイトメトリープロファイルを取得します。
次に、FCSファイルをコンピューターに転送し、ファイルを適切な分析ソフトウェアにインポートします。最初の制御ファイルを前方散布図で開き、y 軸を対数スケールに設定します。次に、生きている人口の周りに多角形のゲートを作成します。
次に、生細胞との散布図高さプロットによる側散乱領域を作成し、ダブレットを除外する長方形のゲートを設定します。次に、これらのゲートを使用して、適切な蛍光チャネルで実験サンプルファイルを分析して、それぞれの象限で関心のある集団を特定します。BJ線維芽細胞を仙台リプログラミングウイルスでリプログラミングすると、DF1線維芽細胞とは異なる速度でSSEA4+CD44細胞が生成され、多能性幹細胞様SSEA4+CD44細胞の割合を早期に比較することで、リプログラミングの進行を追跡できることが実証されました。
フローサイトメトリーの時間経過では、CD24-CD44+およびEpCAM陰性CD44+線維芽細胞はダブルネガティブ集団を形成し、その後、それぞれCD24+CD44およびEpCAM陽性CD44多能性幹細胞様細胞様細胞に移行し、リプログラミングの進行をさらに概説します。再播種後のリプログラミング培養物のリアルタイムイメージングは、それらのコンフルエンスの対数増加に対応する緩やかなコロニー形成を示し、リプログラミングの完了時に最終的な多能性陽性および線維芽細胞陰性マーカー発現を示しています。さらに、レポーター遺伝子を使用すると、位相コントラストの下でコンフルエンスを測定することができ、全コンフルエンスと比較して観察されるGFPコンフルエンスがより緩やかに増加します。
実際、この代表的な実験では、19日目のGFPコンフルエンスは、完全なリプログラミングに対応する全コンフルエンスの半分未満でした。この手法を習得すれば、リプログラミングイベントに関する情報を解明し、ヒト線維芽細胞のリプログラミングの動態を追跡するために使用できる可能性があります。この手法は、さまざまな開始体細胞組織、使用されるリプログラミング技術、およびリプログラミングイベントを解明するための培地マトリックスの組み合わせを調べるためにも使用できます。
このビデオを見れば、ヒト線維芽細胞のiPS細胞へのリプログラミングを追跡するためのリアルタイムモニタリングと細胞表面マーカー発現の活用方法について十分に理解できるはずです。
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概要
本研究では、フローサイトメトリーを用いて、体細胞から人工多能性幹細胞（iPSC）へのリプログラミングをリアルタイムでモニタリングするためのプロトコルを提示します。ここでは、iPSC作製過程における多能性幹細胞マーカーの速度論的な測定と、イメージングに基づく評価に重点を置いています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 幹細胞生物学
- 細胞リプログラミング
- フローサイトメトリー
背景
- iPSCの作製を理解することは、再生医療において極めて重要です。
- リプログラミングのキネティクスは、使用する体細胞組織や技術によって異なります。
- 細胞表面マーカーをモニタリングすることで、リプログラミングの移行過程を追跡することが可能です。
- リアルタイム解析により、リプログラミング効率への理解が深まります。
研究目的
- 体細胞リプログラミングの進行を可視化し、追跡すること。
- さまざまな要因がリプログラミングのキネティクスにどのように影響するかを評価すること。
- iPSC作製をリアルタイムでモニタリングするための信頼性の高い手法を提供すること。
使用された手法
- 多能性マーカーの速度論的測定のためのフローサイトメトリー。
- イメージングに基づいた細胞形態およびマーカー発現の評価。
- リプログラミング中の移行をモニタリングするための細胞表面マーカー解析。
- 線維芽細胞の取り扱いおよび解析に関する詳細なプロトコル。
主要な結果
- iPSC作製のリアルタイムモニタリングに成功した。
- 体細胞の種類によってリプログラミング効率に差があることが観察された。
- フローサイトメトリーにより、多能性マーカーの発現を効果的に追跡した。
- イメージングにより、リプログラミング中の形態学的変化に関する知見が得られた。
結論
- 本プロトコルは、iPSCリプログラミングを研究するための堅牢な手法を提供します。
- リアルタイムモニタリングは、幹細胞生物学の研究を大幅に向上させることができます。
- リプログラミングのキネティクスを理解することは、iPSC技術を改善するために不可欠です。
よくある質問
産業上の重要性
体細胞リプログラミングのリアルタイムキネティック測定により、バイオファーマの研究開発において、多様な細胞源およびリプログラミング技術におけるiPSC生成効率を定量的に評価することが可能になります。このアプローチは、リプログラミングの結果に対する予測的な信頼性を提供することで、標的のバリデーションおよびメカニズム的なリスク軽減をサポートし、細胞治療開発におけるポートフォリオの意思決定に寄与します。本手法は、標準化され再現性のある読み取り値を通じて、初期の探索メトリクスを前臨床バリデーションへと結びつけることで、トランスレーショナルな連続性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：SSEA4+CD44-およびCD24+CD44-集団を、多能性幹細胞様転換の定量的指標として追跡することで、治療仮説の検証を可能にします。
- 運用上の価値：フローサイトメトリーを用いた、体細胞種やリプログラミング技術などの独立変数の単離により、生物学的なリスク低減を支援します。
- 予測的価値：さまざまなマトリックスと培地の組み合わせにおけるリプログラミング速度を比較することで、高効率なシステムを優先的に選択し、リード同定を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状態： 位相差または蛍光チャンネルにおいて、コンフルエンスに基づく半定量的な指標を確立することで、ダウンストリームのワークフローに向けて検証済みの生物学的システムを準備します。
- 再現性： コロニー形成のリアルタイムイメージングおよび、ダブレットを除外して生存細胞集団をゲートするフローサイトメトリーのタイムコースを通じて、アッセイの標準化を図ります。
- スクリーニングの拡張性： 14日間にわたり6〜8時間ごとにウェル全体の連続イメージングを可能にすることで、縦断的なキネティック解析を実現し、プラットフォームの再利用性を強調します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：多様な遺伝的背景や疾患表現型にわたるリプログラミングの進行状況の比較を可能にすることで、疾患との関連性について検討します。
- 前臨床段階との整合性：リプログラミング完了時に、最終的な多能性陽性マーカーおよび線維芽細胞陰性マーカーの発現を測定することにより、基礎研究から前臨床検証までの連続性を記述します。
- リスク調整後の意思決定：レポーター遺伝子のコンフルエンスの相関を用いて、部分的なリプログラミングと完全なリプログラミングを区別し、次段階へ進むかどうかの決定を行います。例えば、19日目にGFPのコンフルエンスが全コンフルエンスの半分未満であった場合などがこれに該当します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、リプログラミングの進行に関する定量的かつ時間分解能の高いデータを提供することで、仮説検証からリード化合物の同定、さらには前臨床研究に至るまでの創薬の連続的なプロセスへと統合されます。
- 探索生物学： BJおよびDF1線維芽細胞などの細胞タイプ間におけるSSEA4+CD44-の割合を早期に比較することで、本手法がどのように仮説検証、経路の解明、および生物学的リスクの低減をサポートするかを説明します。
- スクリーニング： 生きた単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析および画像ベースのコンフルエンス測定を通じた、アッセイの準備状態、再現性、および定量的なアウトプットについて記述します。
- 分析： 多能性マーカー陽性細胞の割合、コンフルエンスキネティクス、およびサイドスキャッター面積対スキャッター高さプロットによるダブレット除去を含む、測定項目、リードアウト、および統計的アウトプットを強調します。
- トランスレーショナルリサーチ： 線維芽細胞からiPSC状態への形態変化とマーカー発現を追跡することで、本手法を前臨床の連続性に結びつけ、SSEA4およびTRA-1-60染色によるバイオマーカーの整合性をサポートします。
- エンタープライズ再利用： 本手法を単発的なテクニックではなく、異なる出発体となる体細胞組織、リプログラミング技術、および培地マトリックスの組み合わせに適用可能な、再利用可能な能力として定義します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 予測の信頼性、ターゲットのバリデーション、リプログラミング軌道におけるメカニズム的な曖昧さの低減。
- 運用上の価値： 研究室間および細胞株間におけるキネティクス測定の標準化、再現性、およびスケーラビリティ。
- 戦略的価値： iPSCベースの治療法開発における、より的確なGO/NO-GO決定、資本効率の向上、および後半段階における生物学的リスクの低減。
- ポートフォリオへの影響： 定量的なリプログラミング効率およびキネティクスプロファイルに基づく、リスク調整後の優先順位付けと推進決定。
実施上の検討事項
- フローサイトメトリー、免疫蛍光染色、およびライブセルイメージングにおける専門的な科学的知見が必要である。
- インキュベーター、ウェル全体スキャン可能なイメージャー、およびFACS対応フローサイトメーターを含む、装置および分析インフラストラクチャが必要である。
- 抗体パネル、ゲーティング戦略、および画像解析プロトコルのチーム間標準化が必要である。
- 異なる線維芽細胞の由来やリプログラミングベクターなど、モデルシステム間の適応に関する検討が必要である。
- 解離時の細胞損傷を避けるためのtrypsin-EDTAの慎重なタイトレーションの必要性や、コンフルエンスに基づく指標の半定量的な性質などの実用的な制限がある。
