ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法

このガラス表面官能基化プロセスの全体的な目標は、目的の細胞を穏やかに捕捉し、放出できるようにすることです。この方法は、腫瘍血管新生の分野における重要な疑問に答えるのに役立ち、薬剤耐性を示す細胞バイオマーカーのスクリーニングを可能にします。この手法の主な利点は、事実上あらゆる関心のある細胞タイプに対して完全にカスタマイズ可能であることです。

細胞タイプに特異的な抗体がある限り、その表面をその捕捉に適合させることができます。この方法は、がんの血管新生に関する洞察を得ることができますが、より個別化された治療レジメンの開発には精製サンプルが必要であるため、他の疾患にも適用できる可能性があります。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、デスチオビオチンとアディビンファミリーとの相互作用を利用して、細胞を捕捉するための可逆的な放出メカニズムを開発しようとしていたときでした。

テキストプロトコルに従って酸素プラズママシンでガラス表面を5分間洗浄した後、50マイクロリットルのAPTESと2.45ミリリットルのエタノールを円錐管に組み合わせて、2.5ミリリットルの2%再構成3-アミノプロピルトリエトキシシラン、またはAPTES溶液を調製します。APTES溶液をガラス表面にピペットで移し、表面を覆って室温のプラットフォームシェーカーに50分間置き、APTES層を均一に分散させます。その間に、オーブンを55°Cに予熱し、8ウェルプレートと24ウェルプレートの場合は°C55°Cに、ガラス皿の場合は90°Cに予熱します。

シェーカーからプレートを取り外した後、エタノールを使用して、テキストプロトコルに従ってガラス表面をすすぎます。窒素ガス100%で表面を乾燥させます。次に、8ウェルプレートと24ウェルプレートをオーブンに2時間、ガラス皿をオーブンに1時間入れます。

次に、37.5マイクロリットルのDMSOに1.5ミリグラム/ミリグラムのDSBを混合し、2,462.5マイクロリットルの0.1モルMES緩衝液、pH 6に2,462.5マイクロリットルのEDCを添加することにより、2.5ミリリットルのd-デスチオビオチン、またはDSB溶液を調製します。次に、2 つのソリューションを組み合わせます。15分後、1マイクロリットルのBMEを加えて、DSBとEDCの間の反応を急冷します。

高温のAPTES機能化ガラス表面をオーブンから取り出し、5〜10分間冷まします。ガラス表面にMESバッファーを追加し、ピペットを70度の角度で保持して、先端が直接表面を向かないようにガラス表面をすすぎます。次に、ウェルの角などの固定点からバッファーを排出して引き出します。

次に、MESバッファーを使用してさらに2回すすぎます。ガラス表面にDSB溶液を塗布します。それらをシャーレ内の湿らせたペーパータオルに移し、ディッシュを覆い、冷蔵庫で18〜24時間インキュベー

摂氏4度でのインキュベーション後、このビデオで前述したように、PBSを使用して各ガラス表面を3回すすぎます。次に、ストレプトアビジンまたはSAVストック溶液を0.4ミリグラム/ミリリットルに希釈し、ガラス表面に均一に塗布して薄い層を形成します。ガラスを18〜24時間インキュベートした後、150マイクロリットルのPBSを使用して各表面を3回すすぎます。

次に、ペーパータオルを脱イオン水で濡らし、プレートを囲む14センチメートルのシャーレに平らに置いて、ウェル内の水分を保持します。ペトリ皿をガラス面で覆い、必要になるまで摂氏4度のバイオセーフティレベル1冷蔵庫に入れます。細胞捕捉を行うには、細胞のT175フラスコから培地を吸引します。

次に、PBSを使用して細胞をすすぎ、バッファーを吸引します。フラスコに10ミリリットルの非酵素的リフティング剤(細胞解離溶液など)を加えます。その後、摂氏37度で6分間インキュベートします。

6分後、10ミリリットルの冷たいHBSSを追加して、リフティング剤を希釈します。次に、20マイクロリットルの細胞をピペットで取り、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞懸濁液を500 x g、摂氏4度で5分間遠心分離します。

そして、HBSSを使用して、細胞を1ミリリットルあたり10倍から6番目の細胞に再懸濁します。ピペットを上下に動かして細胞を溶液に再懸濁し、抗体の結合を減少させる可能性のある細胞凝集を減らします。次に、細胞懸濁液を別々の制御溶液と実験溶液に分割します。

ビオチン化抗体をそれぞれの細胞溶液に加え、エンドオーバーエンドミキサーで摂氏4度で30分間インキュベートします。ビデオの前半で示したように、150マイクロリットルのHBSSを使用して、8ウェルプレートで機能性ガラスを3回洗浄します。細胞溶液をウェルに加え、シェーカーの上で氷上で45分間インキュベートします。

その間に、滅菌HBSS中のビオチンの20ミリモル溶液を調製します。次に、インキュベーション後、150マイクロリットルのHBSSを穏やかに使用して、ガラスから細胞溶液を洗い流します。すすぎをさらに2回繰り返した後、各リリースウェルに150μリットルのビオチン溶液を加え、20分間インキュベートして反応を進行させます。

HBSSを使用して細胞を洗浄することにより、非特異的に結合した細胞を回収します。その後、テキストプロトコルに従って蛍光イメージングと分析に進みます。コントロールとしてフラスコ内の生細胞の画像を含めます。

この実験では、MCF7GFP細胞を機能化された表面に曝露し、細胞の60%をHLA-ABC抗体を用いて捕捉しました。20ミリモルビオチンに曝露すると、捕捉された細胞の80%が放出されました。

ここに示すように、MCF7GFP細胞をRAW 264.7細胞と混合すると、RAWマクロファージの50%が捕捉され、その後、20マイクロモルビオチンを添加すると、捕捉されたRAW細胞の80%が放出されました。この図は、ポジティブコントロールのRAWマクロファージが蛍光活性を示さないことを示しています。しかし、ネガティブコントロールMCF7GFP細胞はGFP蛍光陽性です。

過剰な抗体は細胞捕捉を減少させる可能性があるため、抗体濃度はHLA抗体のミリリットルあたり0〜10,000ナノグラムに滴定することによって最適化されました。その結果、理想的な抗体濃度は1ミリリットルあたり100〜1, 000ナノグラムであることが示されました。また、細胞最適化実験では、捕捉できる細胞の理想的な濃度は、10の1倍から5番目の細胞まで、10の1倍から6番目の細胞までであることがわかりました。

一度習得すれば、この技術は3日で、実験時間は6時間未満で完了します(夜間のインキュベーションは含まれません)。この手順を試みる際には、実験中に細胞洗浄物を収集することを忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、フローサイトメトリーなどの他の方法を実行して、目的の細胞がどのような受容体発現レベルを持っているかなどの追加の質問に答えることができます。

その開発後、表面機能化は、生体材料分野の研究者が、さまざまな病気や怪我の患者へのインプラントなど、材料のバイオセーフ統合を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ガラス表面を表面官能基化して目的の細胞を捕捉して放出し、下流の分析を可能にする方法について十分に理解できるはずです。アジ化ナトリウム中で生細胞を扱うことは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、適切なトレーニング、PPE、廃棄などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。