高感度免疫組織化学を使用してシトシンの修飾された形態の検出

この免疫化学プロトコルの全体的な目標は、ペルオキシダーゼ標識二次抗体の使用とチラミドシグナル増幅に基づいて、さまざまな組織および細胞の状況における修飾型シトシンの空間分布を評価することです。この方法は、修飾された形態のシトシンの生物学的機能を理解するために必要な空間情報を提供しない他の技術の限界を克服する。さらに、この方法は、修飾された形態のシトシンとタンパク質系統マーカーの同時検出を可能にし、それらの核局在の研究に使用することができます。

この手順を開始するには、野生型CD1マウス胚および成体脳組織の再水和組織切片を氷冷した4%PFAまたは4%FAのいずれかに室温で15分間置いて固定します。次に、PBSで切片を室温で5分間洗浄することにより、余分な固定剤を取り除きます。次に、PBXで満たされたCoplinジャーに組織切片を室温で30分間入れて、組織切片を透過化します。

その後、PBTでセクションを短く洗って、余分なPBXを取り外します。次に、透過処理した切片を2 N HClに室温で60分間置き、DNAの脱純度化を行います。次に、切片を10ミリモルのTris-Hclに室温で30分間移し、HClを中和します。

または、切片をPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。切片をPBTで室温で5分間インキュベートします。その後、組織切片の周囲から液体を慎重に取り除きます。

それまでの間、ティッシュ切片を湿らせておきます。疎水性バリアペンを使用して、セクションに触れずにセクションを囲みます。その後、切片を100マイクロリットルのブロッキング溶液で、湿ったチャンバー内で室温で1時間インキュベー

次に、1:5000 希釈のマウスモノクローナル抗 5 hmC 一次抗体と 1:1000 希釈のウサギポリクローナル抗 5caC 一次抗体の 100 μL で、組織切片をブロッキング溶液中で室温で 1 時間インキュベートします。あるいは、摂氏4度で一晩インキュベーションを行います。次に、PBTを充填したCoplinジャー内の切片を室温で5分間ずつ3回洗浄し、余分な抗体を除去します。

次に、余分なPBTを取り除き、必要に応じて、PBTには疎水性バリアを弱める可能性のある洗剤が含まれているため、セクションを疎水性バリアペンで再度囲みます。その後、ブロッキング溶液中でヤギ抗ウサギHRP標識抗体を1:400希釈し、ロバ抗マウス555標識抗体を1:400希釈します。次に、組織切片を100マイクロリットルの二次抗体混合物に含み、湿潤チャンバー内で室温で1時間インキュベー

その後、PBTを充填したCoplinジャーで組織切片を室温で5分間ずつ3回洗浄します。次に、組織切片をチラミドシグナル増幅バッファーで1:200希釈の100マイクロリットルのチラミドに室温で2分間移します。インキュベーション時間は、チラミド溶液を、シグナル強度とチラミドベースのシグナル増幅の持続時間との間の線形関係が観察されるチラミドシグナル増幅キットの個々のバッチごとに実験的に最適化する必要があるというものでした。

直後に、スライドをPBTで5分間ずつ3回洗浄することにより、余分なチラミド溶液を除去します。余分なPBTを慎重に取り除き、すぐに封入剤を滴下して切片を覆います。ティッシュ部分にカバースリップをそっと置き、マニキュアでカバースリップを密封します。

その後、組織切片を摂氏4度に数時間保ってから顕微鏡検査を行います。脳組織切片における5hmCの分布を決定するために、このエピジェネティックな修飾の同時検出を、有糸分裂後ニューロンのマーカーであるNeuNを用いて行いました。免疫組織化学的解析により、NeuN陽性細胞と共局在する顕著な5hmC染色が優れているのに対し、NeuN陰性グリア細胞はゲノム5hmCのレベルが低いことが明らかになりました。

分化神経幹細胞における5caCの分布を決定するために、グリア分化誘導の3日後に神経幹細胞の固定培養物にグリアマーカーGFAPを用いてこのマーカーを共染色した。神経幹細胞や成熟アストロサイトとは異なり、GFAPを発現する細胞の大部分で強い5caCシグナルが観察されました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約8時間で完了します。

この手順を試行する際には、すべての試薬と材料をサンプルと一緒に準備しておくことを忘れないでください。この手順に続いて、修飾型シトシンの核分布に関する追加の質問に答えるために、共焦点イメージングを行うことができます。これは、それらの潜在的な生物学的機能の解読に貢献することができます。

2 N Hclの取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、安全キャビネットや保護服などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。