Adenofection：枯渇-レスキュー実験によって細胞Morphodynamicsにおける分子シャペロンの役割を研究するための方法

この手法の全体的な目的は、単一細胞レベルでの生物学的プロセスの機能解析に向けて、細胞の完全性とタンパク質のホメオスタシスを維持した条件下で、枯渇レスキュー実験を可能にすることです。

この手法は、有糸分裂や細胞分化などの細胞動態におけるタンパク質の機能や構造要件に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、標的タンパク質を枯渇させると同時に、細胞集団の大部分において、そのタンパク質の変異体を生理的レベルに近い状態で再導入できることです。

まず、ガラス底ディッシュをフィブロネクチンでコーティングします。1 mg/mLのフィブロネクチンストック溶液を、滅菌PBSで100倍に希釈して使用します。

表面全体を覆うように、各35 mLディッシュに1 mLずつ加えます。37 °C、5% CO2条件下で1時間インキュベートします。インキュベーションの間、10% FBSを添加したalpha MEMと、0.05% trypsin EDTAの分注液を37 °Cに予熱しておきます。

45分間のインキュベーション後、細胞溶液の調製を開始します。HeLa-RFP-H2B細胞を培養した10 centimeterプレートから培地を吸引します。その後、0.05% trypsin EDTA 1.5 millilitersを用いて、緩やかに2回洗浄します。

最後に吸引した後、プレートに0.5 millilitersのtrypsin EDTAを残し、37 °C、5% carbon dioxideで2～3分間、細胞をインキュベートします。

プレートを軽く叩き、顕微鏡下で細胞層を観察して、すべての細胞が剥離したことを確認します。次に、10 millilitersの培地を加え、緩慢に数回ピぺッティングして細胞を分散させ、細胞懸濁液を15 milliliterチューブに移します。

ヘモサイトメーターを用いて、細胞懸濁液の10 µLサンプルを計数します。次に、ガラスボトムディッシュからフィブロネクチン溶液を吸引します。細胞を播種する前に、フィブロネクチンを乾燥させないようにしてください。

2 mLの培地を用いて、35 mmディッシュ1枚あたり1.5×10⁵個の細胞を播種するための細胞懸濁液を調製します。ウイルス導入前の細胞数をカウントするため、条件数に加えてさらに1枚の35 mmプレートを播種します。30〜45分間インキュベートします。インキュベート時間が経過した後、顕微鏡下で細胞を確認し、ここに見られるように細胞が十分に分散していることを確認します。プレートをインキュベーターに戻し、翌日まで細胞を培養します。

播種した翌日に、細胞密度が少なくとも50%に達していることを確認します。細胞密度が50%を下回ると、ウイルスの導入効率が低下し、細胞あたりのタンパク質発現のばらつきが増大し、細胞毒性が高まります。次に、以前と同様に、予備の播種皿から細胞を回収して細胞数をカウントします。細胞を効率的に導入するために必要なウイルスの量を算出します。各条件ごとに1.5 milliliterのマイクロセントリフュージチューブにラベルを貼り、400 microlitersの温めたalpha MEM minusを加えます。氷上でウイルスの分注量をゆっくりと融解させた後、必要な量の各ウイルスをチューブに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。次に、細胞から培地を吸引した後、ウイルス混合液をゆっくりと滴下します。細胞を37 degrees Celsius、5%carbon dioxideの条件下でインキュベートします。1時間のあいだ15分おきに、滅菌フード内でプレートを慎重に揺らし、細胞全体がウイルスで覆われるようにします。少量の培地を用いることで、ウイルスと細胞の接触を促進させます。

インキュベーション後、各プレートに1.6 millilitersのalpha MEM minusを緩やかにピペッティングし、合計容量を2 millilitersにします。次に、2 millimolarのチミジンを添加して細胞周期の同期を開始し、さらに2時間インキュベートします。

その間に、マイクロチューブに滅菌水 139 µL、1 M 塩化カルシウム 50 µL、および 20 µM siRNA 11 µL を加え、siRNAトランスフェクションミックスを調製します。siRNAが不要な場合は、siRNAと同量を滅菌水に置き換えて、空のトランスフェクション（コントロール）を行います。塩化カルシウムsiRNA混合液に、HBSS-2X溶液をゆっくりと滴下します。200 µLピペットを用いて空気注入により2回緩やかに混合します。沈殿が小さいほどトランスフェクション効率が向上するためです。その後、この混合液を室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、各プレートに 200 µL をゆっくりと滴下し、撹拌して混ぜ合わせます。プレートを 37 °C、5% CO2 下で16時間インキュベートします。

翌日、ディッシュをインキュベーターから取り出し、組織培養フードへ移動させます。温めたHEPESで細胞を2回、2 mLずつ洗浄した後、2 mLのalpha MEM minusを添加し、再びインキュベーターに戻します。

7時間後、プレートに2 mMのチミジンを添加し、インキュベーターに戻します。温度変化が細胞周期の長さに影響するため、一度に操作する細胞プレートは4枚までとしてください。翌日、siRNAのトランスフェクションおよびウイルス感染から48時間後に、温めたPBS 2 mLで細胞を2回洗浄し、ライブセルイメージング用にフェノールレッド不含の$\alpha$-MEM 2 mLを添加します。そのまま7時間インキュベートします。

加湿された5%二酸化炭素制御の温度調節チャンバーを備えた倒立顕微鏡を用いて、有糸分裂期の細胞の短期的ライブセルイメージング実験を行います。撮影前に、チャンバーが適切な温度である37 °Cに達していることを確認してください。

培地を適切に平衡化させ、温度変化によるフォーカスのドリフトを防ぐため、イメージングの1時間前に培養皿を顕微鏡チャンバー内に設置します。細胞の有糸分裂の状態を確認してください。この時点で、細胞の10〜15%が有糸分裂の初期段階にある必要があります。

平衡化の時間に、先行実験で決定したイメージ取得パラメータを設定します。フォトブリーチングは細胞損傷を引き起こし、有糸分裂の進行を妨げるため、適切な解像度を確保しつつ、フォトブリーチングを回避することが重要です。取得間隔を超えない範囲で十分な解析細胞数を確保できるよう、条件ごとに、有糸分裂期に進入した細胞を含む視野をいくつか選択します。すべての視野を選択したら、フォーカスを再調整し、速やかに取得を開始してください。

回転ディスク共焦点システムを用いた一般的なセットアップでは、4つの異なる条件、1プレートあたり7つの視野、2つのカラーチャンネルを使用し、75分間にわたって1.5〜2分の間隔で撮影を行います。使用する蛍光マーカーに応じて、細胞の有糸分裂表現型を解析するための明確な基準を決定してください。

左側に示すBAG3-GFPのプラスミドDNAによるトランスフェクションとは対照的に、右側に示す組換えアデノウイルスを用いたアデノフェクションでは、低い感染多重度において細胞集団の大部分で、より均一かつ効率的なBAG3-GFPの発現が可能になります。この代表的なウェスタンブロットは、BAG3特異的siRNAおよび組換えアデノウイルスBAG3-GFPによるアデノフェクションによって、内因性BAG3の効率的な枯渇と、内因性レベルに近いレベルでのBAG3-GFPタンパク質の再導入が可能であることを示しています。ここで示されているように、プロテотоキシックストレス誘導剤であるMG132で処理したHeLa細胞とは異なり、アデノフェクションしたHeLa細胞ではストレス誘導性熱ショックタンパク質のレベルに検出可能な上昇が見られないため、アデノフェクションはタンパク質の恒常性を維持できることがわかります。ここでは、コントロールsiRNAおよびBacMam-GFP alpha Tubulin、BacMam-RFP ActinをアデノフェクションしたHeLa細胞の共焦点タイムラプス画像に示されるように、細胞の有糸分裂の進行がアデノフェクションによって著しく妨げられないことがわかります。

このグラフは、有糸分裂に異常が見られる細胞の割合を示しています。赤色のバーで示されるように、BAG3特異的siRNAのみをアデノウイルス導入した細胞では、有糸分裂の欠損レベルがおよそ2倍に増加しましたが、黒色のバーで示されるBAG3-GFPの再導入により、コントロール細胞に近いレベルまで回復しました。

このビデオを視聴することで、アデノフェクションを用いた枯渇レスキュー実験の実施方法について十分に理解できるはずです。この手法は、複数の細胞背景において構造機能解析のためのハイポモルフィック・ノックダウンを構築するための、迅速かつ簡便なシステムを提供します。この方法に従うことで、特定の機能における目的タンパク質の重要な構造的要件を特定することが可能です。その後、ゲノム編集の他のアプローチを用いることで、関与するメカニズムをさらに深く究明することができます。