TEM分析のための低細胞数とサンプル調製のための代替的アプローチ

この手順の全体的な目的は、少数の細胞数でサンプルを調製し、効率的かつ再現可能な方法でTEM解析を行うことです。この手法は、生体内の細胞のあらゆる構造を明らかにし、生物医学分野におけるより優れた生理学的設定を提示するのに役立ちます。本技術の主な利点は、少数の細胞数から定性的および定量的な結果を再現可能な形で得られることです。

まず、FACSを用いて10,000個の造血幹細胞（HSC）を、10% FBS添加のIsocoves改良Dulbecco培地600 µLを含む1.5 mLマイクロ遠心チューブに分取します。スイングローターを備えた遠心機を使用し、分取したHSCを1,000 ×gで10分間遠心分離します。

緩やかな吸引を用いて、培地を 200 µL 残してすべて取り除きます。細胞を固定するために、新鮮に調製した 2X 固定液 0.2 mL を加え、室温で 1 時間インキュベートします。次に、0.1 M カコジレート緩衝液 600 µL を加えて細胞を洗浄します。

細胞を再度、今度は30°Cで遠心分離します。遠心分離後、バッファーを200 µLまで除き、カコジレートバッファーで調製した2 mg/mLのエバンスブルーを200 µL加え、室温で20分間インキュベートして細胞を染色します。0.1 Mのカコジレートバッファー600 µLを用いて、細胞を3回洗浄してください。

その後、細胞を残り200 µLのバッファーで再懸濁し、細胞懸濁液を0.5 mLチューブに移します。この段階で、チューブ内にペレットが確認できるはずです。卓上遠心機を用い、1,000 ×gで10分間遠心分離します。

次に、視認できるようになった小さな細胞ペレットを乱さないように注意しながら、緩衝液を静かに取り除き、チューブ内に50 µLの緩衝液を残します。15 mLチューブに200 mgの低融点アガロースを5 mLの0.1 Mカコジル酸緩衝液に加えて、4%アガロース溶液を調製します。チューブを100 mLガラス瓶に入れた沸騰水に移し、アガロースを融解させます。

細胞懸濁液の入ったチューブに、アガロース溶液を200 µL加えます。直ちに1,000 ×g、30 °Cで10分間遠心分離します。細胞がチューブ底部の半凝固状態のアガロース内にペレット状に回収されたことを確認した後、直ちにチューブを4 °Cまたは氷上に20分間置き、アガロースを凝固させます。

27ゲージの針を用いて、細胞ペレットを含む凝固したアガロースを、0.1 Mカコジル酸緩衝液が入った35 mLプラスチック製ペトリ皿に慎重に移します。メスを用いて、細胞ペレットを含む凝固したアガロースを約1〜2 mmの1つの断片に切り出します。その後、それを新しい1.5 mLチューブに移します。

0.1 M カコジレート緩衝液を 600 µL 加え、ピペットを用いて緩衝液の添加と除去を繰り返し、アガロース細胞ペレットを洗浄します。アガロース細胞ペレットから緩衝液を除去し、ドラフトチャンバー内で保護衣と手袋を着用した状態で、1% 四酸化オスミウム溶液を 1 mL 加えます。細胞ペレットを 4 °C で 1 時間インキュベートします。

インキュベーション後、サンプルを3回洗浄します。キャップ付きの20 mLガラスシンチレーションバイアルに移します。次に、エタノール系列を用いてサンプルの脱水を行います。

次に、エタノールで希釈し段階的に濃度を高めたLX 112樹脂を用いてサンプルの浸透処理を行い、その後、100%樹脂中で60分間のインキュベーションを2回繰り返します。ピンセットを用いて、サンプルをピラミッドチップ形状のゴム製モールドの底へ慎重に移動させ、サンプルの上に純樹脂を注いでモールドを満たします。樹脂を重合させるため、サンプルを60 °Cで72時間インキュベートします。

樹脂が重合したら、ゴム製型をねじることで型から取り出します。重合した樹脂ピラミッドの中に、細胞の小さな黒い塊が見えるはずです。シアノアクリレートを用いて、切片作成用のマウントシリンダーに重合樹脂ピラミッドを固定します。

ブロックをウルトラミクロトームに装着した後、カミソリ刃とダイヤモンドナイフを用いてピラミッド状のブロックをトリミングし、上下が平行で側面が均等な角度の、短く幅の広い台形にします。次に、ダイヤモンドナイフを用いて細胞ペレットの周囲をトリミングし、細胞ペレットを含むアガロース片の周囲のプラスチック部分を除去します。ウルトラミクロトームで1 µmの厚さに薄切し、まつ毛ツールとメタルループを用いて、切片をウォーターボートからガラススライドへと移します。

次に、スライドを37 °Cのホットプレートに置いて乾燥させます。0.22 µmフィルター付きの注射器を用いて、切片にteluatine blue溶液を1滴滴下し、3分間インキュベートします。その後、蒸留水でスライドを洗浄し、切片を乾燥させます。

乾燥後、光学顕微鏡で切片を確認し、細胞の位置を特定します。次に、ダイヤモンドナイフを用いて超薄切片を作成します。その後、アイラッシュツール（睫毛ツール）を使用して、ウォーターボートから2〜3枚の切片を200メッシュのグリッド上に移動させ、ガラス製ペトリ皿に配置します。

切片を乾燥させるため、グリッドを入れたディッシュを30°Cに設定したホットプレート上に30分間置く。1%酢酸ウラニルを滴下し、室温で10分間インキュベートしてグリッドを染色する。その後、蒸留水を用いて6〜8回洗浄する。

室温でReynolds鉛 citrateを用いて5分間染色した後、6〜8回すすぎます。グリッドを入れたガラス製ペトリ皿を37 °Cのホットプレートに移し、切片を乾燥させます。最後に、電子顕微鏡を用いて87 kVで切片を観察・分析します。

ここでは、小さな細胞ペレットを含むブロックから作製した、トルイジンブルーで染色したセミシン切片を低倍率で示しており、細胞クラスターが確認できます。この高倍率画像では、細胞の完全な形態が示されています。この図は、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡を用いて解析したウルトラシン切片による細胞クラスターの俯瞰視野を表しています。

ここに単一のHSCを示しており、細胞の形態および超微形態が良好に保存されていることがわかります。個々のHSCの高倍率で詳細な電子顕微鏡写真では、細胞内の超微形態が示されています。さらに、高倍率像により、ミトコンドリアなどの細胞内オルガネラの構造と完全性が良好に保存されていることが捉えられています。

この手技に習熟すれば、5〜6時間で実施可能です。さらに、高度なブルー染色およびアガロース包埋を行い、その後通常のTEM処理を適切に行えば、5〜6日かかります。したがって、このビデオを視聴することで、TEM解析のための実際の細胞調製からサンプルの準備方法までを十分に理解できるはずです。