フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

この分析法の全体的な目標は、蛍光間隔アッセイを使用して膜タンパク質の細胞表面発現を定量化することです。この手法の主な利点は、フローサイトメトリーアッセイにより、1回の実験で大量の生細胞に定量化可能なエンドポイントを提供できることです。この技術の意味は、心室性不整脈の診断と治療にまで及びます。なぜなら、これらの病状は、心臓イオンチャネルの輸送に欠陥を引き起こす遺伝子変異と関連していることが多いからです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、タンパク質機能を損なわず、標識抗体の存在下で強力な蛍光シグナルを生成する、エピトープに適した外外挿入部位を特定するのに苦労します。この手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるBenoite Bourdinです。まず、細胞内C末端でmCherryとDNAコンストラクトを二重化します。

また、細胞外に対向するヘマグルチニンエピトープを発現させ、蛍光抗体を用いて測定し、膜タンパク質の細胞表面発現を推定することができます。次に、標準的な手法を使用してTSA201細胞のプレートを90%コンフルエントに達するまで培養します。各サンプルについて、トランスフェクション試薬を2本のチューブに調製します。

4マイクログラムのDNAと250マイクロリットルの還元血清培地が入った1.5ミリリットルのチューブを1本、10マイクロリットルのリポソーム媒介トランスフェクション試薬と250マイクロリットルの血清還元培地が入った2本目のチューブを準備します。2つのチューブを静かに混合し、室温で5分間インキュベートします。次に、チューブ1とチューブ2の内容物を穏やかに混合し、リポソームDNA複合体を室温で20分間インキュベー

培養細胞に複合体を加え、培養皿を静かに揺らします。皿を摂氏37度に戻し、5%の二酸化炭素雰囲気下に24時間置きます。トランスフェクション試薬を添加してから24時間後、培地を培養皿から取り出し、予め温めた400マイクロリットルのトリプシン-EDTAで細胞を慎重に洗浄します。

次に、400マイクロリットルのトリプシン-EDTAを加え、皿を5分間インキュベートして、細胞が皿から分離できるようにします。剥離したら、ペニシリンまたはストレプトマイシンを含まない1ミリリットルの冷培養培地を細胞に追加して、酵素消化を停止します。培地をプレート上で4〜5回静かにピペットで動かし、表面からすべての細胞を洗い流します。

次に、細胞を滅菌済みの1.5ミリリットルチューブに集め、すぐに氷の上に置きます。次のステップでは、氷冷溶液を使用し、細胞を4度に保ち、表面エピトープの内在化を防ぎます。また、蛍光シグナルの光退色を制限するために、細胞の光への曝露を減らします。

次に、チューブを遠心分離して細胞をペレット化します。次に、得られた上清を慎重に吸引して廃棄します。ペレットを再懸濁して、1ミリリットルのPBSを使用してシングルセル懸濁液を調製します。

次に、チューブを短時間遠心分離します。ペレット状にして細胞を再度懸濁し、培地を完全に除去します。次に、細胞ペレットを600マイクロリットルのPBSに再懸濁します。

細胞濃度を測定し、ミリリットルあたり少なくとも300万個の細胞に調整します。次に、細胞を新しい1.5ミリリットルのチューブに分割します。特異的染色と非特異的染色を区別するための適切なコントロール、および追加の細胞染色および細胞内染色のための適切なコントロールを必ず含めてください。

同位体コントロール抗体は、バックグラウンド染色のレベルを評価するのに役立ち、一次抗体、縁起良好な同位体、および蛍光色素と一致する必要があります。コントロールアイソトープ抗体と蛍光抗体は同じ濃度で使用することが重要です。膜タンパク質の細胞表面発現を推定するには、まず蛍光光標識抗体を用いて、細胞外に面するHAエピトープのみを標識します。

次に、FITC標識モノクローナル抗HA抗体を5μg/mLでチューブに添加します。細胞を短時間ボルテックスしてから、暗闇のロッカープラットフォームでインキュベートします。暗所から細胞を取り除き、900マイクロリットルのPBSを追加します。

次に、チューブを遠心分離して細胞をペレット化し、上清を吸引します。次に、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁し、細胞を短時間ボルテックスして細胞を洗浄します。その後、遠心分離ステップを繰り返して、細胞を再度ペレット化します。

この洗浄ステップを合計3回繰り返して、結合していない抗体を除去します。最終洗浄後、細胞を500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、単一細胞懸濁液を5ミリリットルのフローサイトメトリーチューブに移します。サンプルが分析されるまで、セルを摂氏4度の暗所に保ちます。

次に、透過処理した細胞を標識する全タンパク質の細胞内発現を推定します。これは、細胞外標識と同様のプロトコルを用いて達成されますが、サポニンベースの細胞透過化バッファーを添加します。細胞をペレット化し、上清を廃棄し、調製したストックから直接100マイクロリットルの固定透過化溶液に細胞を再懸濁します。

細胞を暗所で摂氏4度で20分間インキュベートします。次に、新たに調製した透過化洗浄バッファー100マイクロリットルを加え、細胞を短時間ボルテックスします。次に、細胞をペレット化し、透過化洗浄バッファーを使用してさらに2回洗浄します。

次に、FITC標識モノクローナル抗HA抗体を5μg/mLおよび100μLの透過化洗浄バッファーで添加します。簡単に言えば、細胞を渦巻き、暗所で摂氏4度で細胞を30分間インキュベートします。次に、透過化洗浄バッファーを100マイクロリットル加えます。

細胞をペレット化し、前に示したのと同じバッファーの100マイクロリットルで3回洗浄します。最終洗浄後、細胞を500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、単一細胞懸濁液を5ミリリットルのフローサイトメトリーチューブに移します。非透過処理細胞と透過処理細胞を同じ日にフローサイトメーターに通します。

まず、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを起動し、フローサイトメトリー中に作成したfcsファイルをインポートします。最初のサンプルをクリックし、側散乱光と前方散乱光のプロットでゲーティングプロセスを開始します。次に、生細胞の周りの楕円アイコンを使用してP1ゲートを描画し、破片、死んだ細胞、または凝集体を排除します。

次に、mCherryとFITCの蛍光強度のチューブパラメータ等高線プロットを描きます。FITCおよびmCherry陽性細胞の周囲にP2ゲートを設定し、蛍光陰性細胞集団の周囲にP3ゲートを設定します。次に、P2 ゲートと P3 ゲートを選択し、元のワークスペース ウィンドウで統計の追加アイコンをクリックします。

countをクリックし、次にmeanをクリックします。最後に、サイトメーターでプローブしたすべてのサンプルにゲートパラメータと統計を適用します。このプロトコールは、TSA201細胞におけるCaV Alpha 2 Delta 1の総発現および細胞表面発現に対するN-グリコシル化の役割を特徴付けるために使用されました。

細胞表面タンパク質発現にアクセスするために、4つの部位、16部位、または部位のないN-グリコシル化部位が破壊された非透過性細胞でHAを測定しました。FITCレベルは野生型で強く、N-グリコシル化細胞を持つ細胞は4カ所で破壊されたが、16カ所で破壊された細胞ではバックグラウンドレベルのみが認められた。透過処理した細胞では、FITC蛍光がすべての条件で増加し、トランスフェクトされたHAタグ付きCaV Alpha 2 Delta 1タンパク質すべてが抗HA FITC抗体によって染色および検出されたことを示しています。

さらに、mCherryの蛍光レベルは、透過処理された細胞と非透過処理された細胞で同程度であり、透過処理によって相対的なmCherryシグナルが変化しないことを意味しました。細胞透過化後に実施されたアッセイでは、透過処理された細胞のFITC蛍光から推測されたか、非透過処理細胞と透過処理された細胞で測定された構成的mCherry蛍光から推測されたかにかかわらず、16の位置が破壊された細胞の総タンパク質発現も有意に減少することが示されました。この手順に加えて、イオンチャネルの発現と機能を相関させるために、追加の生理学的記録を行うことができます。

また、この技術は、遺伝子変異、翻訳後修飾、マイクロRNA、低分子GTPase、および組換え細胞や天然細胞で発現する膜タンパク質の輸送におけるシャペロンの役割など、医療分野の研究者が研究する道を開くものです。このビデオを見れば、組換え細胞でのDNAトランスフェクションの実施方法、NTAC細胞や透過処理細胞の染色方法、サンプルのデータ解析方法などについて理解できるはずです。生細胞での作業には、トランスフィクションのためのヘラミナル液での作業や、薬品の取り扱い時に手袋を着用するなどの注意が必要であることを忘れないでください。