ファストナノ位置決めシステムを用いた単一分子FRET実験から構造情報

高速ナノポジショニングシステムの全体的な目標は、単一分子FRET実験と厳密な統計分析を組み合わせることで、生体分子の構造情報をリアルタイムに提供することです。この手法は、標準的な構造生物学のツールを適用できない高分子のフレキシブルドメインの局在化など、構造生物学の分野における重要な疑問に答えます。他のFRETベースの構造ツールと比較した高速NPSの主な改善点は、最も可能性の高い位置だけでなく、3次元の確率分布を使用してさまざまな色素モデルを比較できることです。

この手法の主な利点は、タンパク質データベースからの構造データと定量的な単一分子蛍光測定を組み合わせることです。手順を開始するには、フローチャンバーとサンプルホルダーを組み立てます。インレットスクリューとアウトレットスクリューを準備するには、シリコンチューブを中空タブスクリューにねじ込み、カミソリの刃でチューブの両端をまっすぐに切断します。

タブネジをサンプルホルダーにねじ込みます。フローチャンバーの石英スライド穴をサンプルホルダーのネジ山に合わせます。ガラスホルダーのネジをそっと締めて、フローチャンバーを所定の位置に固定します。

長さ20センチメートルのシリコンチューブをインレットスクリューとアウトレットスクリューに通します。フローチャンバーを500マイクロリットルのPBSで洗浄します。次に、PBS中の100マイクロリットルのニュートラアビジン溶液でフローチャンバーを洗い流し、インレットチューブの端に液滴が形成されて、空気がサンプルチャンバーに入るのを防ぎます。

操作のたびに入口と出口のチューブをclで閉じて、フローチャンバーから空気を排除します。チャンバーを室温で15分間インキュベートします。次に、ニュートラアビジン溶液を500マイクロリットルのPBSで洗い流します。

プリズムに一滴の浸漬油を加え、プリズムをサンプルチャンバーにねじ込みます。単一分子FRETデータは、全反射蛍光顕微鏡を使用して取得されます。カメラソフトウェアとステージピエゾモーターソフトウェアを起動します。

チャンバーをTIRF顕微鏡のマイクロメータステージに水平に、できるだけまっすぐに、3つのレーザーすべてと交差するように取り付けます。液浸液を追加し、IR反射を確認して顕微鏡の対物レンズに焦点を合わせます。カメラ パラメータ、ファイル パス、および自動インクリメント パラメータを設定します。

ライブカメラフィードを開始し、3つのレーザーすべてを全強度で使用して背景蛍光を漂白します。次に、レーザー強度を下げます。次に、100マイクロリットルの蛍光ビーズ溶液をチャンバーにロードします。

ビーズがチャンバー表面に結合するまで10分待ちます。50〜100ビーズの視野で動画を録画し、高いピーク検出しきい値でバッチ分析を実行します。ムービーファイルをロードし、視野の反対側の角に異なる中心を持つ 2 つのビーズを選択します。

これらのビーズの最大強度のピクセルを選択します。プリズムを取り外して清掃します。2つ目のサンプルチャンバーを用意し、プリズムホルダーをチャンバーにねじ込みます。

チャンバーをマイクロメータステージに取り付けます。次に、ビオチン化蛍光標識サンプルの50〜100ピコモル溶液100マイクロリットルをチャンバーにロードします。分子がチャンバー表面に結合するのを待ちます。

同時に「信号を取る」をクリックして録音を開始し、ドナー励起レーザーをオンにします。レーザー出力を調整して、視野内の分子の少なくとも80%が漂白されるようにし、次に、チャンバーを動かして漂白されていない領域を表示し、次のムービーを録画します。この方法でサンプルチャンバーの残りの部分を漂白します。

TIRF顕微鏡での測定後、取得した単一分子FRETデータを分析して、平均FRET効率を得る必要があります。サンプルのドナームービーとアクセプタームービーのバッチ解析を実行します。次に、バッチ処理された動画ファイルをデータ解析ソフトウェアに読み込みます。

「選択されていません」ボタンをクリックして、個々のFRETフェーズを示します。FRET期間の開始をクリックし、次に漂白によりアクセプター強度が減少する時点、最後に漂白によりドナー強度が減少する時点をクリックします。次のウィンドウで、[はい] を選択して、選択した FRET 効率トレースを保持します。

すべての分子が分析されたら、トレースを保存して次の動画を分析します。解析が完了したら、スクリプトを実行してFRET結果を結合します。デフォルトの入力オプションを使用して、結合されたフレーム単位のFRETファイルをデータ分析ソフトウェアにインポートします。

データをヒストグラムとしてプロットし、非線形曲線近似ツールを使用してガウス分布に近似します。超過値は主なFRET効率です。UV VISと蛍光分光法を使用して、各色素の等方性Forster半径と定常状態の異方性値を決定します。

ナノポジショニングシステムは、よく知られているGPSに触発され、未知の位置であるアンテナといくつかの既知の位置、衛星の位置を特定します。NPS分析を開始するには、FastNPSソフトウェアを起動し、新しいジョブファイルを作成します。ラベル付けされたアンテナとサテライトの位置事前分布を定義するには、ModelDyePrior ウィンドウで、定義する位置の空間分解能を入力します。

高分子内部を除外するには、対応する中心に配置されたPDBファイルを読み込みます。染料の直径とスケルトン化距離を入力します。可能な染料位置の最小位置座標と最大位置座標を入力します。

定義する位置が衛星の場合は、Flexible Linkerによる色素付着を選択し、中心のPDBファイルから原子座標を入力します。リンカーの長さと直径を入力します。「アクセス可能な体積を計算」をクリックし、前の位置を保存して、視覚化のためにエクスポートします。

すべての衛星とアンテナについて、このプロセスを繰り返します。位置を定義したら、「Define Measurement」ウィンドウを開き、新しい色素分子を作成します。その染料に事前に関連付けられた位置をロードします。

蛍光異方性を充填し、適切な色素モデルを選択して、色素を活性化します。すべての染料が定義されるまで、このプロセスを繰り返します。次に、新しい測定値を作成します。

定義された染料からFRETペアを選択します。誤差のある単一分子のFRET効率と、この色素ペアの等方性フォースター半径を入力し、測定をアクティブにします。これをすべての色素ペアについて繰り返します。

次に、計算ウィンドウを開きます。染料が異なるモデルに割り当てられている場合は、[ユーザー定義]を選択します。それ以外の場合は、すべての染料に使用するモデルを選択します。

計算を実行し、結果ウィンドウを開きます。FastNPSを使用する際には、信頼性のある量を最小限に抑えるために、すべての色素にモデルを適合させることを忘れず、もちろん一貫性を保つことが重要です。濃度が90%未満の場合は、[詳細な濃度]をクリックし、濃度が90%未満のエントリーに共通する色素を特定します。

「Define Measurement」ウィンドウを開き、問題の染料のモデルを変更します。[ユーザー定義]モードで計算を再実行します。染料の信頼できる量を単独で、またはバッチとしてエクスポートします。

視覚化ソフトウェアで密度ファイルを開き、信頼性を希望のレベルに調整します。古細菌のRNAポリメラーゼ開放型プロモーター複合体内の未知のアンテナ分子といくつかの既知の衛星分子との間で、単一分子のFRET効率を測定しました。このデータのNPS分析により、これらの色素分子の古細菌RNAポリメラーゼ開放型プロモーター複合体と比較して信頼性のある量が決定されました。

色素分子を使用した5つの異なるモデルと結果を比較しました。信頼できる体積は、色素が未知の向きの円錐内でのみ自由に回転できると仮定したモデルで計算した場合、測定データと一致していました。特にクラシックモデルは、染料が固定された場所にあることをさらに前提としているため、最も保守的です。

これにより、比較的大きな信頼性のあるボリュームが作成されますが、通常、ボリュームは正しい位置を囲みます。高精度のモデルでは、色素が蛍光寿命内で完全に自由に回転できるという仮定を使用します。iso モデルは、クラシック モデルと同様に、染料がアクセス可能なボリューム内の固定位置にあることを前提としています。

meanpos-iso モデルは、すべての可能な位置で動的平均化を前提としています。アイソモデルの信頼できるボリュームは、非アイソモデルによって計算されたボリュームよりもはるかに小さいですが、測定データとは一貫性がありません。私たちは、既存の構造ツールでは解決できなかった問題である過渡錯体の動的構造情報を捉えることができる技術を開発したいと考えていました。

単一分子のFRETデータが記録されると、FastNPS分析は数時間で完了し、異なる色素モデルを迅速に比較することができます。この手順に続いて、実験的な単一分子FRETデータと一致する構造化モデルを取得するために、MDシミュレーションなどの他の方法を後で実行できます。