生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

この実験の全体的な目標は、低酸素条件下でキャップ結合タンパク質を捕捉することです。この方法では、アガロース結合した7つのメチル-グアノシンキャップアナログを利用して、キャップ結合因子とその相互作用パートナーを調査します。この方法は、キャップ依存性翻訳に関与する新規の酸素調節因子の同定など、タンパク質合成の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、細胞が溶解点まで低酸素ワークステーションに保持されることです。この技術の意味は、腫瘍内のがん細胞が非常に低レベルの酸素にさらされ、並進制御が腫瘍の進行に重要な役割を果たすため、がん治療にまで及びます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、Coronaの同僚が最近発表した論文で、組織の酸素化は、細胞が日常的に培養される正常酸素症ではなく、実際には低酸素症と呼ばれるものに近いと報告しているのを読んだときでした。

この手順は、テキストプロトコルに記載されているように細胞培養を開始します。血球計算盤を用いて細胞をカウントした後、150ミリメートルの培養皿に15ミリリットルの完全培地を含ませて、1平方センチメートル当たり2500〜5000細胞の細胞密度を得る。各キャップ結合アッセイに2つの150mmディッシュを使用します。

播種した培養皿をインキュベーターに摂氏37度、二酸化炭素5%の雰囲気に置きます。細胞を少なくとも24時間インキュベートした後、細胞を低酸素ワークステーションに所望の時間置きます。次に、ワークステーションを適切な生理学に設定します。

1つのXリン酸緩衝生理食塩水(PBS)とトリプシンを摂氏37度の水浴で30分間予温します。980マイクロリットルの溶解バッファーを1.5マイクロリットルの遠心分離チューブに分注し、各キャップ結合アッセイを行います。10マイクロリットルの100Xプロテアーゼ阻害剤カクテルと10マイクロリットルの4-ベンゼンスルホニルフッ化物ヒドロクロライドを氷上の980マイクロリットルの溶解バッファーに

各150mmディッシュからメディアを低酸素ワークステーション内の廃棄物容器に捨てます。次に、3〜4ミリリットルの温かい1X PBSで細胞を洗浄し、液体を捨てます。各皿に1ミリリットルの温かい05パーセントトリプシンEDTAを加え、皿を2分間、または細胞がプレートに付着しなくなるまで放置します。

ピペットを使用して、1つのプレートの細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。必要に応じて繰り返して、細胞の各プレートを別々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。マイクロ遠心チューブを6000倍gで90秒間遠心分離し、細胞をペレット化します。

遠心分離後、ペレットを乱さずにピペットを使用してトリプシンを吸引します。200マイクロリットルのPBSをペレットのすぐ上のチューブに優しくピペッティングすることにより、温かい1つのX PBSで細胞を洗浄します。次に、ペレットを乱さずにPBSを吸引します。

次に、調製した1ミリリットルの溶解緩衝液から500マイクロリットルを第1の細胞ペレットにピペットで移します。ピペッティングを上下させて、ペレットを完全に再懸濁します。再懸濁した細胞を第2の細胞ペレットと結合し、ピペッティングで上下させて第2のペレットを再懸濁します。

このプロセスを繰り返して、すべてのペレットを結合し、各サンプルに再懸濁します。次に、ライセートを残りの500マイクロリットルの溶解バッファーと1.5リットルのマイクロ遠心チューブに混ぜ合わせます。低酸素ワークステーションからサンプルを取り出します。

サンプルを摂氏4度で1.5〜2時間回転させることにより、穏やかに攪拌して細胞を溶解します。インキュベーション後、溶解した細胞を1200倍gで摂氏4度で15分間遠心分離し、細胞の破片を除去します。ライセートを新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、ペレットを廃棄します。

上清の一部をウェスタンブロット解析の全細胞ライセートインプットコントロールとして使用するために予約します。キャップ結合アッセイの準備には、ハサミを使用してピペットの先端を取り外し、ビーズスラリーの収集を容易にします。各サンプルについて、50マイクロリットルのブランクアガロースビーズコントロールスラリーと50マイクロリットルのm7GTPアガロースC10リンクビーズスラリーを別々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。

次に、スラリーを500倍gで30秒間遠心分離することにより、ビーズをペレット化します。上清を慎重に取り除き、ビーズをTBSの500マイクロリットルに再懸濁します。これらの手順を繰り返した後、ビーズを500倍gで30秒間ペレット化し、上清を取り除きます。

次に、ライセートを含む上清をブランクアガロースビーズを含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。穏やかに攪拌しながら、摂氏4度で10分間インキュベートします。10分後、ブランクアガロースビーズを500倍gで30秒間遠心分離してペレット

遠心分離後、ビーズに結合しないライセートを、m7GTPアガロースC10結合ビーズが入った1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。ブランクのアガロースビーズを500マイクロリットルの溶解緩衝液に再懸濁し、500時間gで30秒間遠心分離してビーズをペレット化し、上清を廃棄します。これを4回繰り返して、合計5回の洗浄を行います。

ブランクのアガロースビーズを1つのX SDS-PAGEサンプルバッファーに再懸濁します。そして、ビーズを摂氏95度で90秒間茹でます。サンプルを摂氏20度で保存し、将来のウェスタンブロット分析で、目的のタンパク質がビーズに非特異的に結合する天候を観察します。

ライセートをm7GTPアガロースC10結合ビーズとインキュベートし、摂氏4度で1時間穏やかに攪拌し、キャップ結合タンパク質を捕捉します。攪拌後、m7GTPアガロースC10結合ビーズを500倍gで30秒間遠心分離してペレット化します。上清を捨てた後、前回と同様にm7GTPアガロースC10結合ビーズを洗浄します。

ビーズを600マイクロリットルの溶解バッファーに再懸濁し、GTPを最終濃度1ミリモルまで添加します。m7GTPアガロースC10結合ビーズと1ミリモルGTPをインキュベートし、摂氏4度で1時間穏やかに攪拌します。これにより、m7GTPと非特異的に相互作用するタンパク質が解離します。

m7GTPアガロースC10結合ビーズを500時間gで30秒間遠心分離してペレット化します。上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、200マイクロリットルの4つのXDS-PAGEサンプルバッファーを追加します。前回と同様にビーズを洗浄した後、ビーズを1つのX SDS-PAGEサンプルバッファーに再懸濁し、摂氏95度で90秒間煮沸します。

ここに示されているのは、初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞の酸素変動に応答した2つの主要なキャップ結合タンパク質の典型的なm7GTPアフィニティー精製の代表的なウェスタンブロットです。細胞ライセートを8%、5%、3%、または1%の酸素に24時間ばく露しました。レーンには、全細胞ライセートの10%をインプットとして、m7GTPの特異性を測定するために洗浄されたGTP、およびGTP洗浄後にm7GTPビーズに結合したタンパク質が含まれます。

少なくとも 3 つの独立した実験のデータを Image J によって定量し、全細胞ライセートの 10% のインプットに対する相対密度の単位として表しました。その結果、生理的酸素下で培養したヒト細胞は、2つのキャップ結合タンパク質を利用して、翻訳のために異なるmRNAを動員することが示されています。このビデオを見れば、低酸素条件下でキャップ結合タンパク質を捕捉する方法を十分に理解できるはずです。

この手順を試みる際には、酸素がこれらの翻訳開始因子の生化学的特性を急速に変化させる可能性があるため、細胞を溶解点まで低酸素ワークステーションに保持することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、ポリソーム分画などの他の方法を実行して、低酸素条件下で活性翻訳と結合するキャップ結合タンパク質などの追加の質問に答えることができます。