ニトロセルロース結合アッセイを用いて細菌ヒスチジンキナーゼ自己リン酸化の定量化

このプロトコールの全体的な目標は、精製された細菌のヒスチジンキナーゼの自己リン酸化を定量化することです。この方法は、2成分シグナル伝達の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、ヒスチジンキナーゼの自己リン酸化に対するタンパク質間相互作用における同族刺激の影響など。

この技術の主な利点は、形成されたホスホヒスタディジンのピコモルを正確に検出し、ヒスチジンキナーゼの速度論的パラメータを取得するために使用できるハイスループットな方法であることです。ポスドクとして、私はニトロセルロース膜のろ過を使用して、タンパク質結合放射性リガンドを定量しています。したがって、細菌のヒスチジンキナーゼにおけるヒスチジンのリン酸化を定量するための同様の技術を開発することは理にかなっています。

この手順は、テキストプロトコルに記載されている試薬と材料の準備から開始します。96ウェルドットプロット装置をセットアップするには、8センチメートル×12センチメートルのニトロセルロース膜を切断します。ニトロセルロースをドットプロット装置に配置します。

装置が密閉され、すべてのウェルがメンブレンで完全に覆われるように、メンブレンが適合していることを確認します。ろ液を収集するには、装置をセカンダリサイドアームフラスコに接続します。バルブステムから適切なチューブを接続して、二次フラスコを傾けることなく装置を快適に使用できるようにします。

次に、セカンダリーサイドアームフラスコをアスピレーター真空源に接続します。装置に真空を当てて、装置が完全に密閉されていることをテストします。装置が正しく組み立てられていれば、すべてのウェルに強い真空が存在します。

すべてのチューブ接続部は、パラフィルムまたはサランラップで包むことができ、しっかりと密閉することができます。開始前に、テキストプロトコールに記載されているように、4つの反応成分すべてを4つのXストック溶液として調製します。等量の反応バッファー、ヒスチジンキナーゼ、および二重蒸留水を混合します。

これらの反応成分を室温で短時間平衡化させます。反応を開始するには、1容量のγ-32 P ATP溶液を加え、上下にピペットで混合します。経過した反応時間をタイマーで追跡し、目的の時間だけ反応が進行するのを待ちます。

反応を抑えます。反応のアリコートを325ミリモルリン酸に加えます。すべての反応が終了するまで、急冷した反応をすぐに氷の上に置きます。.

組み立て済みの96ウェルドットプロット装置を二次容器に入れます。この容器は、使用後に装置と膜が放射性になるため、装置を簡単に分解できるほど大きくする必要があります。96ウェルドットプロット装置に真空を適用します。

装置が真空下になったら、急冷した反応を各ウェルのニトロセルロースメンブレンに直接慎重にピペットで移します。すべての反応がメンブレンにロードされるまで、このプロセスを繰り返します。ニトロセルロースの結合能は斑点のあるヒスチジンキナーゼの量よりも大きいため、正しくロードすると、ほぼすべてのキナーゼがメンブレンに結合すると想定できます。

使用する装置によっては、ニトロセルロースに穴を開けないように注意してください。すべての反応がニトロセルロースと接触したことを観察します。一部の反応が井戸の壁にくっつくのは簡単です。

100マイクロリットルの氷冷した25ミリモルリン酸でウェルを洗います。これにより、ウェルに閉じ込められた可能性のある反応量がメンブレンに到達し、すべての反応の完全なローディングが保証されます。ボリューム全体がメンブレンを通るようにします。

掃除機を切る前に、装置を慎重に分解してください。現時点では、装置とニトロセルロース膜の両方が放射性であることに注意してください。二次容器から装置の部品を取り出さないでください。

鉗子を使用して、ニトロセルロース膜を装置から約200ミリリットルの25ミリモル氷冷リン酸の容器に慎重に移します。洗浄液は放射性物質であるため、この容器に蓋をします。このとき、真空が遮断されている場合があります。

洗浄膜付きの容器をロッカーの上に置きます。メンブレンを20分間静かに揺らします。20分後、使用済みの洗浄液を大きなバケツに慎重にデカントし、一時的な廃棄物保管に使用します。

200ミリリットルの氷冷した25ミリモルリン酸を膜に加えます。この方法でメンブレンを少なくとも3回洗浄して、メンブレンからバックグラウンドのγ-32 P ATPシグナルを除去します。3回目の洗浄後、使用済みの洗浄液の放射線をガイガーカウンターでテストします。

洗浄液中にシグナルがなくなるまで、メンブレンの洗浄を続けます。メンブレンが十分に洗浄されたら、メンブレンを短時間風乾させます(通常は5分以内かかります)。テキストプロトコールに記載されているように、ニトロセルロースをリングリーンに曝露した後、Ponceau Sの染色および脱染色に備えます。

ニトロセルロースメンブレンをPonceau S染色溶液に1〜2分間短時間浸します。脱染する前に、メンブレン全体を汚れで濡らしてください。次に、メンブレンから余分なPonceau Sをデカントします。

ヒスチジンキナーゼの斑点のみが染色されるまで、メンブレンを二重蒸留水ですすいでください。この手順は、すべてのスポットに検出可能な量のタンパク質が含まれている場合にのみ機能することに注意してください。はさみを使用して、ニトロセルロース膜の各スポットを切り取ります。

汚れたスポットの端に沿って完全にカットする必要はありません。メンブレンが十分に洗浄されていれば、切り欠きスポットのサイズが異なることによる背景はごくわずかです。重要なのは、反応ごとにスポット全体を切り取ることだけです。

鉗子を使用して、各スポットをシンチレーションバイアルに慎重に移します。リン32はチェレンコフ放射によって容易に検出できるため、シンチレーションカクテルは必要ありません。次に、1 cm×1 cm四方のニトロセルロース上に、数希釈した gamma-32 P ATP 溶液を見つけます。

鉗子を使用して、各正方形をシンチレーションカクテルのないシンチレーションバイアルに慎重に移します。これらのサンプルは、ATP 溶液の 1 ピコモルあたりの 1 分あたりのカウントを決定するための標準曲線を生成するために使用されます。ニトロセルロースメンブレンのポンソー染色をここに示します。

染色はすべてのサンプルで均一であり、すべてのサンプルが均等にロードされていることを示しています。ニトロセルロースメンブレンのX線撮影結果は、各スポットにおける放射性標識ホスホヒスチジンの相対レベルを示しています。4行目と8行目はネガティブコントロールで、過剰なATPがニトロセルロース膜から洗い流されることを示しています。

ヒスチジンキナーゼの自己リン酸化の定量の代表的な結果をここに示します。このデータは、メンブレンから切り出された各スポットのシンチレーションカウントから生成されます。ここに示されているATPのピコモルあたりの1分あたりのカウントの標準曲線もシンチレーションカウントから生成され、各サンプルに存在するホスホヒスチジンのピコモルを計算するために使用されます。

この手順に続いて、キナーゼ活性を調節すると仮定されている同族刺激やタンパク質の導入などの他の方法を実験に追加して、これらの添加物がキナーゼ活性に及ぼす影響などの追加の質問に答えることができます。放射能を扱う作業は非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行する際には、適切な放射線安全トレーニング、個人用保護具の使用、シールドなどの予防措置を常に行う必要があります。