原発性前立腺細胞の分化のための迅速なフィルターを挿入ベースの3D培養システム

このフィルターインサートベースの患者由来初代細胞用3D培養システムの全体的な目標は、前立腺がん研究のためのより生物学的に関連性のあるin vitroモデルシステムを確立することです。初代ヒト細胞を使用することにより、この方法は前立腺発生生物学および前立腺がんにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、分化した初代前立腺細胞を確立するための比較的迅速なin vitro方法論であり、RNA、DNA、タンパク質などの生体分子の迅速な分離も可能

組織学やRNAおよびタンパク質の収集のためのフィルターインサート上の細胞の処理は繊細で時間に敏感であるため、これらの方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。生物学的安全キャビネット内のチャンバー間の拡散を制限するために、インサートの底面に0.1%ゼラチンの薄層を塗布し、乾燥させます。この手順をさらに 2 回繰り返します。

次に、ゼラチンコーティングインサートの内部チャンバーに細胞を適用し、最大2週間培養します。2週間後、培養したフィルターインサートを、以下で詳述する適切なダウンストリームアプリケーションのいずれかに直接適用します。この手順を開始するには、外側のチャンバーからPBSを吸引し、内側のチャンバーからPBSを慎重に取り除きます。

培養インサートは、アプリケーションを開始する準備ができるまでPBSで短時間保持できますが、メンブレンが乾燥しないようにしてください。次に、各内部チャンバーに0.25%トリプシンEDTAの100マイクロリットルを追加します。次に、摂氏37度で5分間インキュベートします。

その後、ピペッティングを上下させながら、200マイクロリットルのピペットでメンブレン表面の細胞を短時間慎重にこすり落とします。その後、摂氏37度で1分間インキュベートします。1分後、250マイクロリットルのコンディショニングメディアを最初の内部チャンバーに加え、ピペットで優しく上下させてフィルターをすすぎます。

その後、再懸濁した細胞を同じ培地条件の隣接するフィルターチャンバーに移し、ピペッティングを上下に繰り返します。1 つの条件の挿入ごとにこの手順を繰り返します。次に、細胞を採取し、1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。

各内部チャンバーを追加の100〜200マイクロリットルのコンディショニング培地ですすぎ、残りの細胞を収集し、それらを1.5ミリリットルの遠心分離チューブに追加します。次に、細胞を4°Cの微量遠心分離機で5分間回転させます。その後、上清を吸引し、細胞ペレットを1, 000マイクロリットルのPBSで一度洗浄します。

細胞を再び微量遠心分離機で摂氏4度で5分間回転させます。5分後、PBSを吸引し、後で使用するためにサンプルを摂氏マイナス80度で凍結します。この手順では、200マイクロリットルのグアニジニウムチオシアン酸フェノールクロロホルムまたは同様の抽出試薬を内部チャンバーに加え、ピペッティングで上下させて膜表面の細胞を短時間攪拌します。

次に、抽出試薬で細胞を室温で5分間インキュベートし、外側のチャンバーを乾燥させます。その後、抽出溶液をピペッティングしてフィルターメンブレンを洗浄します。6ウェルプレートを傾け、残留液体を吸引することにより、できるだけ多くの抽出試薬を収集します。

フィルターがインサートから分離する可能性があることに注意してください。解離したフィルターメンブレンが取り付けられている場合は、洗浄します。次に、できるだけ多くの抽出試薬を回収し、DNA、RNA、またはタンパク質の精製と回収に関するメーカーのプロトコルに従います。

細胞を洗浄し、チオシアン酸グアニジンでろ過する場合は、過度の攪拌により質の悪いRNAが生成される可能性があるため、注意が必要です。フィルターインサートからタンパク質を単離するには、フィルターインサートを氷上の6ウェルプレートに置きます。次に、10マイクロリットルのタンパク質溶解バッファーをインナーチャンバーに加えます。

ピペッティングを上下させながら、20マイクロリットルのピペットでメンブレン表面の細胞を攪拌し、こすり落とし、溶解バッファーに気泡が発生しないようにします。その後、フィルターインサート付きの6ウェルプレートを氷上で10分間インキュベートします。掻き取りを繰り返してから、メンブレン表面を溶解バッファーですすいでください。

6つのインサートからライセートを採取し、氷上の1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。次に、最初のメンブレンを追加の10マイクロリットルの溶解バッファーですすぎ、次のフィルターに移します。所定の実験条件のすべてのインサートに対してこの手順を繰り返し、残留溶解緩衝液を回収し、1.5ミリリットルチューブに加えます。

サンプルを氷上でさらに5分間インキュベートします。その後、最高速度で4°Cで15分間回転させます。完了したら、ライセートを新しい1.5mmチューブにピペットで移します。

次に、タンパク質濃度の分析に進むか、ライセートを摂氏マイナス80度で保存します。この手順では、500マイクロリットルと1ミリリットルの10%NBFをそれぞれ内側と外側のチャンバーに追加します。摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、アウターチャンバーからNBFを吸引し、1.5ミリリットルの遠心分離チューブに1ミリリットルのHEA処理ゲルを追加します。アガロースを電子レンジで低電力でゆっくりと溶かし、アガロースが溶けるまで10秒間のパルスを繰り返します。HEAは、使用する準備ができるまで固化を防ぐために摂氏37度の温かい浴槽に保管してください。

次に、NBFをインナーチャンバーから取り外します。25マイクロリットルの溶融HEAを内部チャンバーに塗布し、アガロースを2〜5分間固化させます。次に、2つのフォーム組織学パッドを10%NBFで濡らし、1つのパッドを埋め込みカセットに入れます。

HistoGelを使用してフィルターインサート上の細胞層の完全性を保護することは、組織学的切片作成のための無傷の細胞層を保存するための重要なステップです。その後、11番のブレードメスを使用して、プラスチックインサートチャンバーの下側からフィルターに切り込みを入れ、部分的に解放します。100〜200マイクロリットルのNBFをペトリ皿に入れ、部分的に外れたフィルターをNBFに浸します。

10番のブレードメスで、インサートチャンバーの内側からフィルターの中央をそっと押して、フィルターをインサートバレルから完全に外します。フィルターの一部がまだバレルに取り付けられている場合は、メスで切断します。その後、HEAコーティングフィルターを半分にカットします。

フィルターの各半分を、準備した組織型カセットのフォームパッドに置きます。次に、2番目の10%NBFに浸したスポンジをカセットに追加し、フィルターを挟みます。次に、カセットをスナップシールします。

それをNBFに入れ、一晩インキュベートします。この明視野画像は、多孔質膜の上に多層化された細胞層を示しています。核、P63、およびアンドロゲン受容体の個々の蛍光画像と、3つの蛍光マーカーすべてのマージが示されています。

最後に、明視野と免疫蛍光の複合オーバーレイが示され、細胞とフィルターに対する蛍光シグナルの局在が確立されます。ここでは、フィルターインサートの断面画像を、無傷の前立腺の管上皮層と比較しています。この技術を習得すると、2週間で完了し、細胞とフィルターインサート、または目的の生体分子を適切に実行すれば、30分未満で最終分離できます。

この手順を実行する際は、フィルターインサートを操作するときは、セル層や下にあるフィルターに損傷を与えないように、常に注意を払うことを忘れないでください。この手順に続いて、ウェスタンブロット、RNAマイクロアレイ、プロテオーム解析などの他の方法を実行して、パスウェイ解析やがん細胞に関する追加の質問に答えることができます。この技術は、前立腺がんの分野の研究者が、原発性前立腺細胞を使用して前立腺生物学と前立腺がんの基盤をよりよく探求するための道を開くのに役立ちます。

このビデオを見れば、この3D培養システムから培養された初代前立腺細胞を適切にセットアップし、回収する方法について十分に理解できるはずです。