細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

このセルマイクロアレイプラットフォームの全体的な目標は、細胞分化と牽引力の両方の測定値を微小環境コンテキストの関数として相関させることです。この方法は、組織工学の分野における重要な質問に答えるのに役立ち、幹細胞生物学の基本的な研究と分化プロトコルの最適化の両方を可能にします。この技術の主な利点には、そのスループット、生化学的および生物物理学的な手がかりを変化させる能力、免疫蛍光顕微鏡と牽引力顕微鏡(TFM)の両方によるエンドポイントの読み取りが含まれます。

これらの方法を使用してきましたが、肝前駆細胞の分化を理解している人は、他の動脈細胞の種類や組織の状況に容易に適用できます。実験の成功は、高品質のハイドロゲル基質と牽引力顕微鏡の両方とアレイ化プロトコルの統合にかかっているため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。TFMを使用して細胞基質相互作用のライブ評価のために、シラン化した35 mmガラス底ペトリ皿上にポリアクリルアミドハイドロゲルを含む蛍光ビーズを作製するには、まず、テキストプロトコルに記載されている溶液中にガラス基板を調製します。

シラン処理した35mmガラス底のペトリ皿をガラス乾燥トレイに入れ、20マイクロリットルの9対1のプレポリマービーズを光開始剤溶液にピペットで移します。各皿を12mmの円形カバースリップでやさしく覆い、泡が生じないようにします。蛍光ビーズをハイドロゲルの表面に分布させるために、ディッシュを反転させ、室温で20分間放置します。

反転したまま、ディッシュを365ナノメートルのUVAに10分間さらします。必要に応じて重合時間を最適化します。次に、ハイドロゲルを1モルのHEPES緩衝液に浸し、室温で暗所で一晩放置します。

重合したハイドロゲルを傷つけないように注意しながら、カミソリで慎重にカバーを外します。ハイドロゲルをホットプレート上で摂氏50度で乾燥するまで脱水します。ハイドロゲルは、室温で3ヶ月間暗所で保存することができます。

生体分子を印刷するためのバッファーと、テキストプロトコルに記載されているソースプレート用のバッファーを準備します。テキストプロトコルで説明されているようにクリーンピンをロードした後、マイクロアレイヤを準備し、メーカーのソフトウェアを使用してプログラムします。次に、加湿器ユニットの電源を入れます。

設定値を相対湿度65%に調整し、レオメータが設定値と一致するまで待ちます。ソースプレートを適切なアダプターに配置します。次に、脱水したヒドロゲル基質を適切なアダプターに入れます。

プログラムのパラメータを調整して、ソースプレートのレイアウト、アレイ設計、および目的の形式を正確に反映します。アレイの作製を開始します。湿度が相対湿度65%を下回っていないこと、およびピンが詰まっていないことを1時間に1回以上確認してください。

湿度が予想外に下がった場合は、アレイを一時停止して加湿器を満たし、関連するチューブの結露を取り除きます。ピンが詰まっている場合は、アレイを一時停止してピンをクリーニングするか、事前にクリーニングされたピンと交換します。プログラムが完了したら、作製したアレイをアルミホイルで覆われたスライドボックスまたはマイクロプレートに置きます。

アレイを室温、相対湿度65%で一晩放置します。私たちの経験では、最も一般的な問題はアレイの製造に関連しています。蛍光標識分子、一般的なタンパク質染色剤、および免疫蛍光法を用いて作製したアレイの技術的品質と堅牢性を確認することをお勧めします。

作製翌日、アレイ35 mmシャーレをPVS中のペニシリン-ストレプトマイシン1容量あたり1%容量の3 mLに浸します。アレイ化された基板をUVCで30分間露光します。次に、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を細胞培養培地と交換します。

細胞を採取してカウントした後、35 mmのシャーレあたり3 mLで細胞をアレイに播種します。アレイ培養物を摂氏37度、CO25%で2時間から24時間、または人口の多い細胞島が形成されるまでインキュベートします。播種密度と播種時間は、細胞や特定の用途に応じて調整できます。

細胞アイランドの形成を考慮した後、アレイ培養物を3 mLの予熱細胞培養培地で2回洗浄します。この時点で、目的の適切な制御および治療を生物学的システムに追加することができる。アレイの媒体を1〜2日ごとに交換して、治療の濃度を維持します。

アレイ培養を開始してから1〜5日以内に、TFMを使用して細胞基質相互作用のライブ評価を行います。アレイ培養物を含む35 mmシャーレを、TFM測定用のロボットステージを備えたインキュベート倒立蛍光顕微鏡に移します。1つの皿で、位相差顕微鏡を使用して個々の細胞島の位置と焦点面をマークします。

遠赤色蛍光顕微鏡に切り替えて、ビーズを視覚化します。次に、前の手順で保存した各位置に戻り、フォーカス平面のz座標を修正して、セルアイランドの下のビーズの最初のレイヤーのみが焦点が合うようにします。新しい座標を保存し、すべての細胞島の自動イメージングに進み、解離前の位相コントラストと遠赤色蛍光画像をキャプチャします。

次に、150マイクロリットルのBSA/SDS溶液をディッシュに慎重に加え、5分間待ってから基板から完全に細胞が解離します。位相差顕微鏡を使用して細胞の解離をモニターします。セルアイランドが基板から解離した後、マークされた位置に戻り、ビーズの最初の層にまだ焦点が合っていることを確認します。

これらのビーズが、細胞生成の牽引によって誘発される変形のために平面から外れている場合は、焦点が合った平面のz座標を修正して、再び焦点が合うようにします。補正したz座標を保存し、すべての島の自動イメージングを繰り返して、解離後の遠赤色蛍光画像を撮影します。残りのディッシュについても、これらの手順を繰り返します。

プロテインA/G結合ノッチリガンドはギザギザで、デルタライクリガンドはハイドロゲル中での保持が改善されました。ノッチリガンドの提示は、緑色の胆管細胞マーカーの存在によって示されるように、肝臓前駆細胞の分化を胆管細胞の運命に向けても促進しました。ノッチリガンドに対する応答は、5つの細胞外マトリックス(ECM)タンパク質について定量化され、リガンドに対する肝臓前駆細胞の応答がECMの状況に依存することが示されました。

小さなヘアピンRNAノックダウンは、リガンドデルタのようなデルタやギザギザのリガンドを持たない前駆細胞を生成するために利用されました。次に、細胞にノッチリガンドを1つ、1つのようにデルタ、4のようなデルタを突起して提示しました。アレイ化されたノッチリガンドに対する応答は、いずれかのリガンドの細胞内因性発現によって異なりました。

これらの画像は、肝臓前駆細胞の分化が基質の硬さとECM組成の両方に依存することを示しています。定量分析の結果、コラーゲン4は軟質基質と硬質基質の両方で分化をサポートし、フィブロネクチンは硬質基質の分化のみをサポートすることが明らかになりました。代表的なヒートマップは、コラーゲン4の基質剛性が低い状態で持続的な牽引応力が胆管細胞への分化を促進することを示唆しています。

この知見は、牽引応力の平均二乗平均平方根の値を定量化することで確認されました。このビデオと付属のプロトコルは、アレイ化された基質上で細胞培養を行い、牽引力顕微鏡を使用して細胞基質の相互作用を測定するためのハイドロゲルとアレイを製造するための主要なステップを提供しました。技術に慣れた後、各実験は適切に実行すれば、わずか1〜2週間で完了することができます。

この分析法では、定性的なPCR、免疫ブロッティング、標準スケールのメカノバイオロジー軸、またはその他の補完的な分子生物学技術を使用して、細胞培養を使用して高スコアのアレイ条件を検証する必要があります。この汎用性の高いプラットフォームは、幹細胞の分化やがん細胞生物学など、さまざまな細胞や組織の状況における細胞機能のハイスループット研究に適用できます。