スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

このスペクトルサイトメトリー技術の全体的な目標は、蛍光スペクトル全体を使用して異なる蛍光色素を区別することです。さらに、このプロトコルにより、独立したパラメータとして自家蛍光の実装が可能になり、固形臓器から単離された細胞の適切な分析が可能になります。この方法は、免疫学や幹細胞生物学の発展、例えば希少細胞集団の同定方法などの重要な疑問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、多数のパラメータを同時に分析し、固形組織の自家蛍光を管理する独自の能力です。この方法は、腸や心臓に由来する単一細胞懸濁液の調製に使用されますが、肺、骨格、筋肉、肝臓、脂肪、腎臓などの他の臓器にも適用できます。まず、成体マウスから小腸を分離して洗浄します。

次に、ティッシュをペーパータオルの上に置き、鋭利なはさみを使用して、パイエルのパッチを慎重に取り除きます。腸を縦に切って開き、1センチに分けます。次に、組織を10%のFCSを添加した30ミリリットルのHBSSで満たされたビーカーに移し、摂氏37度で30分間絶えず攪拌しながらインキュベー

インキュベーションが完了したら、細胞懸濁液を15ミリリットルのプラスチックチューブに移し、5分間激しくボルテックスします。次に、懸濁液を氷上で10分間インキュベートして、解離していない大きな断片を沈殿させます。その後、上清を新しいチューブに移し、細胞をGの120倍で7分間回転させます。

ペレット化したら、HBSSで1%FCSの10ミリリットルに細胞を懸濁し、ノイバウアーチャンバーを使用してそれらをカウントします。細胞染色に先立ち、第6腸細胞の1×10を5ミリリットルのチューブに移し、ネガティブコントロールを作製します。サンプルを調製するには、腸細胞の6分の1に1回10を加え、続いて1%FCSを含むHBSSを2ミリリットルで新しい5ミリリットルのチューブに加え、懸濁液をGの120倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。

上清を捨てた後、抗体溶液50μLに細胞を懸濁します。チューブのアルミホイルを包み、細胞を摂氏4度で20分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、HBSS中の1%FCSを2ミリリットル加え、Gの120倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。

上清を捨て、ペレットを200マイクロリットルあたり0.5マイクログラム/ミリリットルのヨウ化プロピジウム溶液に再懸濁します。マウスの胚を斬首した後、その体をシャーレに浸し、事前に濡らしたペーパータオルで裏打ちし、HBSS中の1パーセントFCSを50ミリリットル充填します。実体顕微鏡の下で、胚の胸の右側に切開を行い、心臓の損傷を避けながら胸部を慎重に開きます。

大きな血管をつかみ、肺と胸腺につながっている心臓を引き抜きます。臓器をHBSS中の1パーセントFCSの2ミリリットルで満たされた35ミリリットルのペトリ皿に移します。次に、心臓を周囲の臓器や結合組織から分離します。

心臓を洗浄した後、予熱した酵素溶液1ミリリットルに浸し、細い鉗子とメスを使用して、実体顕微鏡で臓器を1立方ミリメートル片にミンチします。予め加温した酵素溶液をさらに1ミリリットル加え、断片化した組織をキャップ付きの5ミリリットルチューブに移します。試料を摂氏37度の水平位置で15分間インキュベートします。

インキュベーションが完了したら、P1000ピペットで懸濁液を繰り返しピペッティングすることにより、組織を均質化します。次に、サンプルを垂直に配置し、未消化組織の断片が沈殿するまで脇に置きます。上清を50ミリリットルのチューブに移します。

HBSSに10%FCSを2ミリリットル加え、単離した細胞を氷上に保ちます。次に、未消化の組織沈殿物が入った5ミリリットルのチューブに、予め加温した酵素溶液2ミリリットルを加え、残存組織が観察されなくなるまで、前に示したように組織を消化し続けます。得られた細胞懸濁液をGの120倍で10分間遠心分離します。

次に、上清を捨て、カルシウムとマグネシウムのカチオンを含まないHBSS中の1パーセントFCSの1ミリリットルに細胞を再懸濁します。心筋細胞を染色するには、200マイクロリットルの細胞懸濁液を丸底の96ウェルプレートのウェルに移します。プレートをGの480倍で1分間遠心分離し、上清を捨てます。

次に、心臓細胞を抗体溶液100μリットルに再懸濁します。プレートをアルミホイルで包み、摂氏4度で20分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、カルシウムおよびマグネシウムを含まないHBSS中の1パーセントFCSの200マイクロリットルで心臓細胞を洗浄し、懸濁液をGの480倍で1分間遠心分離します。

次に、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを含まないHBSSに1パーセントFCSの200マイクロリットルで細胞を再懸濁し、懸濁液をカルシウムとマグネシウムを含まないHBSSの1パーセントFCSの200マイクロリットルで予め充填した5ミリリットルのチューブに移します。最後に、カルシウムおよびマグネシウムカチオンを含まないHBSSに1パーセントFCSを400マイクロリットル加え、1ミリリットルあたり0.5マイクログラムのヨウ化プロピジウムを含み、70マイクロナイロンメッシュを介して細胞懸濁液をろ過します。細胞を可視化するには、染色したサンプルをフローサイトメトリーにロードしてプレビューをクリックし、取得をクリックしてサンプルの10倍から6番目のイベントまで最大2倍

[分析]タブで、カラーパレットウィンドウを開き、蛍光色素とそれに対応するマーカーを追加して、調査したすべてのパラメーターを登録します。自家蛍光と生存率のパラメータを必ず含めてください。コントロールウィンドウのチューブリストで、コンペンセーションビーズを含む最初の染色サンプルを1つ分析します。

次に、ワークシートでポリゴンデザインツールをクリックし、FSC SSCプロットでビード母集団をゲートします。ゲートをダブルクリックして、ゲートビーズのドータープロットを作成します。そして、ポジティブビーズとネガティブビーズを別々にゲートします。

選択した娘母集団を、正と負のそれぞれの小数部で連続的なゲーティングと外れ値の削除によって検証します。次に、ネガティブゲートとポジティブゲートをアンミキシングウィンドウにアップロードします。次に、チューブリストから未染色の細胞サンプルを選択し、自家蛍光細胞と非自家蛍光細胞のゲートを別々に設計します。

自家蛍光や生存率を含むすべてのパラメータに対してネガティブゲートとポジティブゲートを定義したら、calculateをクリックします。次に、分析したサンプルにアンミキシングを適用します。データを解析するには、SSCとFSCのプロットで細胞をゲートし、ヨウ化プロピジウムで染色された死細胞を除外します。

最後に、関心のあるすべての母集団のゲートを決定します。ここでは、胎児の心臓から単離し、抗TER119、抗CD45、および抗Sca-1抗体で染色した細胞のフローサイトメトリーおよびスペクトルサイトメトリー解析の結果を示します。自家蛍光細胞のサブセットは、2つの従来のサイトメーターによって検出されましたが、スペクトルサイトメトリーでは、これらの細胞は自家蛍光として定義されておらず、CD45、TER119陰性集団に含まれていました。

次に、従来のフローサイトメトリーで自家蛍光細胞として同定されたが、CD31陽性細胞ではない細胞を、心筋細胞に特異的な転写産物の発現について分析しました。自己蛍光細胞集団では、高レベルの心筋トロポニンと列車転写産物のような心房筋細胞が見つかり、従来のフローサイトメトリーでは心筋細胞の大部分が見逃されていることが確認されました。このテクニックを習得すると、適切に準備されていれば、約8時間で完了します。

この手順を試みる際には、細胞が生存し続けることを保証するために、すべてのステップを氷上およびタイムリーな邸宅で実行する必要があることを覚えておくことが重要です。これらの手順に続いて、特定の分子経路に関する質問に答えるために、細胞内タンパク質と追加の表面マーカーの分析を行うことができます。この技術は、免疫学および発生生物学または幹細胞生物学の分野の研究者が、さまざまな臓器から希少な集団を探索し、分離する道を開きました。

このビデオを見れば、細胞組織から細胞を単離して染色する方法や、細胞自家蛍光による制限を克服するスペクトルフローサイトメトリーによる表面マーカー発現の解析方法について、十分に理解できるはずです。ヨウ化プロピジウムの取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常にPPEの使用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。