成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング

この細胞培養技術の全体的な目標は、骨髄神経前駆細胞を濃縮して、機能的なシュワン細胞への分化を促進することです。この方法は、幹細胞と再生医療における重要な問題、つまり、限られた神経前駆細胞の供給源を使用して、心的外傷後の軸索再成長と再髄鞘形成を支援するグリアを生成する方法に対処します。この技術の利点は、効率的な培養条件付けを使用して、骨髄間質細胞からの神経細胞増殖を促進し、自家細胞療法で使用できることです。

培養に2日後、使用済み培地と非接着細胞の75%を除去し、接着細胞を3回の10mmPBS洗浄液ですすいでください。3回目の洗浄後、PBSを10ミリリットルの骨髄ストーマ細胞(MSC)増殖培地と交換し、培養物をインキュベーターに戻します。目に見えるコロニーは、6日目から7日目までに現れるはずです。

10日目に、培養物を新鮮なPBSで洗浄し、1.5ミリリットルの組換え酵素細胞解離試薬で細胞を剥離します。摂氏37度で5分後、MSC増殖培地3ミリリットルを加えて反応を中和し、分離した細胞を遠心分離して回収します。ペレットを5ミリリットルの新鮮なMSC増殖培地に再懸濁し、新しい10センチメートルの組織培養プレートで1平方センチメートルの密度あたり10〜4番目の細胞の4倍で細胞を播種します。

細胞は、継代後2日以内に80〜90%のコンフルエントに達するはずです。低酸素プレコンディショニングの場合は、最初にリングクランプを解放し、露出した部品を70%エタノールで洗浄します。さらに低酸素チャンバーを部品に分解し、層流フードに入れてUV光下で15分間滅菌します。

次に、今示したように、80〜90%コンフルエントMSC培養物を10ミリリットルのPBSで洗浄し、25ミリモルヘップスを添加した新鮮なMSC増殖培地で培養物を処理します。処理した培養物を再組み立てした低酸素チャンバーに入れ、リングクランプを締めます。チャンバーの接続端をシールしてガス漏れがないことを確認し、99%の窒素と1%の酸素の混合ガスを毎分10リットルの流量でチャンバーに流します。

5分後、チャンバーを細胞培養インキュベーターに16時間入れます。翌朝、示したように細胞を分離し、遠心分離により細胞を回収します。ペレットを神経前駆細胞培地に再懸濁し、1平方センチメートルあたり10〜3番目の細胞を6回、低付着性の6ウェルプレートに播種し、摂氏37度、CO25%で12日間培養します。

細胞のかなりの非接着球体は、6日目から7日目までに観察されるべきです。低酸素症の条件付けされた培養では、10日目から12日目までに正常酸素症の培養物よりも多くのニューロスフェアが見られます。12日目に、10ミリリットルのピペットを使用してニューロスフェアを15ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離によってニューロスフェアを収集します。

球体をDMEM/F12に再懸濁し、1平方センチメートルあたり5〜10個のニューロスフェアを、1.5ミリリットルのグリア誘導媒体にポリD-リジンラミニンでコーティングした6ウェルプレートにプレートします。球体細胞培養液を少なくとも7日間保持し、3日ごとに培地をリフレッシュします。後根神経節を採取するには、最初の胚を室温PBSを含む10cmの培養皿に腹臥位の解剖顕微鏡下に移し、脊髄の両側に沿って微小解剖鉗子を挿入します。

鈍的解剖を使用して、鉗子を使用して脊髄を周囲の軟部組織から分離し、首の開口部とテールスタブに沿って脊髄を切除します。解放された脊髄から残りの軟部組織を、脊髄、神経根、および付着した後根神経節のみが残るまで取り除きます。個々の後根神経節をそれらの接続神経根から切り離します。

次に、1ミリリットルのピペットチップを備えたピペットペンを使用して、最大100個の後根神経節をPBSの1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。遠心分離によって神経節を回収し、チューブあたり200マイクロリットルの組換え酵素細胞解離試薬にペレットを再懸濁します。摂氏37度で10分後、200マイクロリットルのピペットチップを使用して後根神経節を再度遠心分離し、後根神経節ニューロン維持培地でペレットを穏やかに粉砕します。

後根神経節細胞を1平方センチメートルあたり10〜3番目の細胞の5倍で播種し、1.5ミリリットルの後根神経節ニューロン維持培地にポリD-リジンラミニンでコーティングされた6ウェルプレートに1ウェルあたり1.5ミリリットルで播種します。摂氏37度、CO25%で2日間培養した後、細胞を洗浄し、ニューロン細胞培養物を新鮮な後根神経節ニューロン精製培地のインキュベーターにさらに2日間戻します。3〜4回のメンテナンスおよび精製サイクルの後、後根神経節細胞培養物は、ニューロンマーカーTuj-1に対して陽性、グリア細胞マーカーS100ベータに対して陰性であるはずです。

Schwann細胞様細胞培養の7日目に、PBSで細胞をすすぎ、続いてウェルあたり0.5ミリリットルの組換え酵素細胞解離試薬で摂氏37度で5分間解離します。細胞ペレットを共培養培地に再懸濁し、シュワン細胞様細胞を精製後根神経節ニューロン培養物に 1 回 10 から 3 番目の細胞 1 平方センチメートルで播種し、摂氏 37 度、CO2 を 5% で 14 日間共培養します。健康な MSC は、多数の継代にわたって維持され、多重能性を失った MSC の四角形の外観とは対照的に、先細りの形態を示します。

拡大したMSCコロニーは、MSCマーカーの発現、造血幹細胞マーカーの不在、および脂肪形成性、骨形成性、および軟骨形成性系統への分化能力を実証すべきである。低酸素プレコンディショニングを受けた健康なMSC培養物は、数とサイズの両方でより大きなニューロスフェアを示しています。後根神経節ニューロンネットワークの純度は、ニューロンマーカーTuj-1の発現と、それに伴うシュワン細胞マーカーS100の不在によって確認することができます。

後根神経節ニューロンとの共培養で14日後、シュワン細胞様細胞は、成熟した運命がコミットしたシュワン細胞の特徴と機能特性を獲得します。一度習得すると、細胞増殖技術が適切に実行されれば、神経前駆細胞の亜集団をヒトまたはラットのBMSCで10日間で拡大することができます。この手順を試行する際、BMSCサンプルにネスチン陽性の神経前駆細胞が与えられていること、およびCD45陽性造血前駆細胞がすべて除去されていることを確認することを忘れないでください。

このビデオを見た後、BMSCを調達する方法、神経前駆細胞の亜集団を濃縮する方法、および神経前駆細胞の分化を運命的にコミットされたシュワン細胞に誘導して、心的外傷後の軸索再成長と再髄鞘形成を促進するために使用する方法についてよく理解できるはずです。この手順に続いて、成熟シュワン細胞などの髄鞘グリアを導き出し、末梢神経系と中枢神経系の両方の脱髄性損傷や疾患の治療法の開発に使用することができます。