光応答性高分子ナノキャリアからのsiRNA放出の時空間制御による遺伝子サイレンシングの予測

これらの手法の全体的な目的は、小干渉RNAを介した遺伝子サイレンシング効率の予測を可能にし、その結果として生じるタンパク質発現レベルを時空間的に制御しやすくすることです。本手法により、構造機能相関や刺激応答性デリバリービークルの解明が可能になります。結合と放出の制御能を高めることで、トランスレーショナルプラットフォームや創薬、さらには再生医療技術への道が開かれます。

この手法の主な利点は、単純なsiRNA放出アッセイと速度論的モデリングに基づき、遺伝子発現の変化を制御および予測できることです。これらの手法では新規の光応答性ポリマーを使用していますが、一連のアッセイは、他の多様な刺激応答性システムを試験するために容易に適応させることができます。まず、pH 6の20 µM HEPES溶液にsiRNAを添加し、32 µg/mLのsiRNA溶液を調製します。

次に、溶解させたmPEGブロックpolyAPN BMAポリマーをpH 6の20 millimolar HEPES溶液に加えて、ポリマー溶液を調製します。濃度を220 micrograms per milliliterに設定すると、N/P比が4となり、これはsiRNAのリン酸基に対してポリマーのアミノ基が4倍存在することを意味します。続いて、ボルテックスミキサーで穏やかに混合しながら、ポリマー溶液を同量のsiRNA溶液に滴下します。

ポリマー添加後、さらに30秒間ボルテックス処理を行います。次に、試料を室温の暗所で30分間インキュベートします。ボルテックスミキサーで穏やかに混合しながら、各ナノキャリア溶液にSTS溶液を滴下します。

SDS添加後、さらに30秒間ボルテックスします。サンプルを3,000 Gsで5秒間遠心分離し、その後、室温の暗所で30分間インキュベートします。365 nanometerフィルターを装着したUVレーザーを校正し、強度を200 watts per square meterに設定します。

次に、ゴムガスケットに穴を開け、洗浄して乾燥させたガラススライドの上にゴムガスケットを配置します。ゴムガスケットの穴の中のガラススライド上に、ナノキャリアSDS溶液をピペットで滴下します。ゴムガスケットに触れないように注意しながら、ガラススライド上に溶液を過剰に載せます。

2枚目のスライドガラスをスライドガスケットの上に載せます。気泡の発生を防ぐため、まずスライドの一端を載せ、その後、もう一端をゆっくりと下ろしてください。ガラスチャンバーの両端にバインダークリップを取り付けて、密着させて固定します。

365ナノメーターフィルターを備えたUVレーザーを用い、強度200 watts per square meterで、所定の時間サンプルに照射します。バインダークリップを取り外し、チャンバーを開けます。次に、照射済みのナノキャリアSDSサンプル25 microlitersをマイクロ遠心チューブにピペッティングします。

溶液を室温の暗所で30分間インキュベートします。各ナノキャリアSDSサンプルの25 µLに、ローディングバッファー溶液を5 µL加えます。サンプルを室温の暗所で10分間インキュベートします。

次に、エチジウムブロマイドで前染色した2%アガロースゲルに、各ナノキャリアSDSサンプルの30 µLをロードします。ゲルを暗所で100 V、30分間電気泳動させます。エチジウムブロマイドフィルターを備えたゲルイメージングシステムを用いて、ゲルの画像を撮影します。

ゲルの画像ファイルを保存し、テキストプロトコルに記載されている通りにバンド強度の定量化に進みます。両面粘着スペーサーから剥離紙を取り除き、粘着面を露出させます。スペーサーをガラスカバースリップに貼り付けます。

ナノキャリアSDS溶液をカバーガラス上にピペッティングします。次に、あらかじめ洗浄したガラススライドをカバーガラスの上に置き、粘着スペーサーの穴がサンプルの中央にくるように配置します。ガラススライドを押し、ガラススライドとカバーガラスがしっかりと密着し、シールが形成されていることを確認します。

FCS測定には、開口数1.2の40倍水浸アポクロマート対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用します。適切な励起レーザーチャンネルを用い、サンプルあたり10秒間の測定を少なくとも30回行います。その後、テキストプロトコルに詳しく記載されている通り、FCSから得られたsiRNA放出データをキネティックモデルに入力し、遺伝子サイレンシング応答を予測します。

in-vitro siRNAデリバリーの準備として、まず6ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を2 mLずつ加えます。インキュベーター内で24時間静置し、細胞を接着および回復させます。リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄した後、血清および抗生物質を含まないトランスフェクション培地を1.5 mL加えて、トランスフェクションの準備を行います。

次に、30 picomolesのsiRNAを含むナノキャリア溶液を25 microlitersずつ各ウェルに加えます。培地をピペットでゆっくりと吸い上げ、混ぜ合わせます。その後、細胞をインキュベーター内で3時間静置します。

トランスフェクション培地を除去し、各ウェルをPBSで洗浄します。次に、添加剤入りの増殖培地を1mL加え、細胞をインキュベーターに入れて30分間回復させます。光刺激による処理の準備として、添加剤入りの増殖培地を除去します。

次に、各ウェルに1 mLのトランスベクション用培地を加えます。本文のプロトコルに従ってUVレーザーの校正を行った後、細胞を37 °Cに設定したホットプレート上に置きます。6ウェルプレートからカバーを取り除きます。

365ナノメーターフィルターを備えたUVレーザーを用い、200ワット/平方メートルの強度で、プレートの上方から所定の時間、細胞に照射します。トランスフェクション培地を除去し、2ミリリットルの添加物入り増殖培地を加えます。その後、分析を行うまで細胞をインキュベーターで培養します。

365ナノメートルの光を完全に遮断し、反射を最小限に抑えるフォトマスクを準備するには、まずフォトマスクに目的の形状をカット、パンチ、または機械加工で作成します。パターンが細胞を含むウェルの中心にくるようにし、反射防止面をプレート側に向けて、フォトマスクを6ウェルプレートの底面に接着します。2本のリングスタンドを約25メートルの間隔で設置し、それぞれのリングスタンドにプラットフォームを取り付けて、プラットフォームの高さが等しくなるように調整します。

プレートを2つのスタンドの上のプラットフォームに載せて、細胞プレートを吊り下げます。365 nanometerフィルターを備えたUVレーザーを用い、強度200 watts per square meterで、サンプルの下方から所定の時間、細胞に照射します。トランスベクション培地を除去し、2 millilitersの添加物入り増殖培地を加えます。

その後、細胞をインキュベーターに入れ、少なくとも24時間回復させます。前述の手法に従い、蛍光顕微鏡を用いて細胞を撮像します。ここでは、遺伝子サイレンシングダイナミクスの単純な速度論的モデリングの例を示します。

光誘導によるsiRNA放出後の時間経過に伴うmRNA、タンパク質、およびsiRNAの濃度を予測するために、モデルを実行した。異なる光照射量に従って放出されたsiRNAの相対量を、速度論モデルの初期siRNA濃度として入力した。その結果得られたタンパク質発現レベルのモデル予測値は、ウェスタンブロッティングによって決定された実験的な発現レベルと一致した。

可視化のため、GFP発現細胞にGFP標的siRNAを処理し、照射前にプレート上に円形のフォトマスクを配置して円形パターンを作成した。光から保護された細胞は、siRNAおよび光処理を行っていないコントロールサンプルと区別がつかない蛍光強度を示した。一方、円形パターン内のほぼすべての細胞でGFP発現が消失しており、siRNAが効率的に放出され、遺伝子ノックダウンが誘導されたことが示された。

さらに、光の使用は細胞レベルのスケールで制御可能な、遺伝子発現を誘発するトリガーとなります。要約すると、本手法により、siRNA放出を時空間的に制御し、遺伝子サイレンシングを事前に予測するための照射条件を迅速に決定することが可能になります。本プロトコルを採用することで、ナノキャリアの安定性と有効性を規定する構造機能相関の解明に寄与します。

この技術は、遺伝子発現の時空間的な制御を必要とする再生医療への応用を可能にする可能性があります。また、これらの製剤は、皮膚がんなどの局所的疾患や、皮膚疾患の治療にも適しています。