コカイン使用障害のモデルラットにおけるキュー反応を測定するためのプロトコル

本プロトコルにおいて、キュー反応性は、コカイン自己投与の中断後における、動物のコカイン探索への動機付けを測定するものです。キュー反応性は、ラットが以前に静脈内コカイン投与に関連付けられたコンテクストおよびキューに再びさらされたときに起こります。キュー反応性は、再発リスクの指標となります。

ここに記載するキュー反応性プロトコルは、再発を修飾する薬物療法を試験し、再発リスクに寄与する遺伝的および環境的要因を調査するための前臨床的な手段です。これは、ヒトの薬物服用および再発の多くの特性と一致する、薬物探索行動のためのオペラント課題です。相の妥当性とトランスレーショナルな有効性を確立するため、コカインの投与量、投与量、および注入時間などの主要なパラメータの最適化が行われています。

本プロトコルでは、コロニールームに少なくとも7日間順化した、生後約8〜9週齢の雄性Sprague Dawleyラットを使用します。順化期間中、ラットは2匹ずつで飼育し、研究期間を通じて毎日ハンドリングを行ってください。研究の全フェーズにおいて、ホームケージ内で飼料を自由的に摂取できるようにしてください。

KmiotekらによるJoVEビデオで概説されている方法を用いて頸静脈カテーテルを留置し、その後、ラットを生理食塩水投与群またはコカイン投与群にランダムに割り当てます。トレーニングでは、テキストプロトコルに記載されている通り、コカイン自己投与のスケジュールをプログラムします。トレーニングチャンバーには、2本の格納式レスポンスレバー、各レスポンスレバーの上部に刺激灯、およびレバーの反対側にハウスライトを設置します。

キュービクルの外部にあるシリンジ注入ポンプから、コカインまたは生理食塩水を投与します。シリンジには23ゲージの針を取り付け、ラットのカテーテルに接続された金属製スプリングリードで保護されたポリエチレンチューブを使用します。コカインまたは生理食塩水は、アクティブレバーの押し下げ後に投与されますが、インアクティブレバーの押し下げ後には投与されません。

溶液は毎日交換してください。各ラットの体重に合わせて、滅菌済み0.9% sodium chlorideで調製した新鮮なコカイン希釈液を使用します。各ラットのシリンジに少なくとも8 mLの溶液を充填してください。

まず、ラットをFR1強化スケジュールで訓練し、1時間あたり7回の注入が3日間連続し、かつ1セッションあたりの総注入数の変動が10%未満となった後、FR5スケジュールへと移行させます。動物をFR5へ進めるタイミングを決定し、カテーテルの開通性が維持されているかを確認するために、自己投与行動のデータを毎日分析することが不可欠です。本プロトコルの最も重要なステップの一つは、訓練の最初の14日間に自己投与をモニタリングし、動物が正常に自己投与を行っているかを確認することです。

自己投与量が劇的に減少した場合、ラットのカテーテルの開通性が失われている可能性があります。セッションの開始時に、シリンジ内に気泡がないことを確認してください。シリンジをポリエチレンチューブに取り付け、注入ポンプに挿入します。

溶液がポリエチレンチューブ内に均一かつ完全に分布するように、シリンジを慎重に調整します。次に、ラットを投与システムに接続し、ファンを備えた換気付き遮音キュービクル内に設置された、それぞれの標準的なオペラント条件付けチャンバーに入れます。実験全体を通して一貫性を維持することが極めて重要です。

ラットは常に同じチャンバーに入れ、そのチャンバー内のアクティブレバーは常に同じ側に配置してください。1日180分のセッションを14日間行い、ラットにレバーへの自由なアクセスを許可します。システムが正常に機能していれば、ラットはどちらのレバーが刺激を提供するかを容易に学習します。固定比率スケジュール（FR1）に基づき、アクティブレバーが作動するたびに0.1 millilitersの溶液が6秒間かけて放出され、同時にケージライトとアクティブレバー上の刺激灯が点灯します。

溶液が放出されるまで1秒間の遅延があります。コカインまたは生理食塩水の投与ごとに、刺激光と注入ポンプが20秒間停止します。この間、ハウスライトは点灯したままであり、レバーを押しても何も起こりませんが、その回数は記録されます。消灯すると、レバーが再び有効になります。

不活性レバーを操作しても、予定された結果は生じません。180分のセッション終了後、攻撃性を示す可能性があるラットを、ゆっくりとした慎重な動作でチャンバーから取り出します。その後、カテーテルを洗浄してください。

セッションの間は、チャンバーを注意深く清掃してください。すべての表面を70%エタノール溶液で拭き取ります。トレーニングセッションの終了後、ラットをオペラントチャンバーへのアクセスがない状態で30日間の強制禁欲状態に置きます。

引き続き、ラットを毎日ハンドリングし、全身状態を観察します。長期間の禁欲期間の後、ラットをオペラントチャンバーに60分間入れ、その後直ちに脳を採取します。このセッションでは、スケジュールされたキュー反応性プログラムを実行してください。

セッション間の脳採取時間を確保するため、各セッションの開始時間をずらして設定します。重要な点として、物質の投与を行わずにポンプの作動音という聴覚的手がかりを刺激の一部として維持するため、シリンジを装着せずにポンプを作動させてください。このセッションは通常通り、トレーニングに使用した自己投与チャンバーにラットを入れた状態で開始します。

このテストでは、以前にコカインまたは生理食塩水を投与したアクティブレバーが押されると、FR1スケジュールでキューのみが提示されます。インアクティブレバーは引き続き何も機能しません。すべてのキュー提示回数、以前のアクティブレバーの押し回数、インアクティブレバーの押し回数、および最初のレバープレスまでの潜伏期間を記録してください。

記載されたプロトコルを用いて研究を実施し、ラットが基準を満たした時点でFR1からFR5へ個別に移行させた。コカイン投与群のラットは、基準に達するまで注入回数を徐々に増加させ、その後FR1からFR5へと移行させた。コカインの手がかり反応性テストから、複数の出力指標を収集した。

例えば、以前にコカインを自己投与したラットは、生理食塩水を自己投与したラットよりも、以前に活性化されていたレバーをはるかに多く押しました。もう一つの重要な出力指標は、最初のレバープレスまでの潜時です。この値に変化が見られる場合、動物が身体的なストレスを受けているか、あるいはコカイン自己投与へのモチベーションが低下している可能性があります。

運動行動課題は、身体的健康状態の変化を評価し、運動機能障害と意欲的な変化を区別するために使用されます。このビデオを視聴することで、ラットに薬物を自己投与させるための訓練方法、自己投与中のカテーテルの開通性維持方法、および断薬後の薬物関連キューに対するキュー反応性を評価して再燃リスクを測定する方法について、十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、ソフトウェアを慎重にプログラミングし、動物を適切に取り扱い、静脈カテーテルを定期的にフラッシュすることが重要です。

本手順に従うことで、コカインの手掛かり反応性を駆動する細胞および分子メカニズムを評価できるほか、コカインの手掛かり反応性を変化させる潜在的な薬物療法の試験を行うことができます。