哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

この手順の目的は、2種類のCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集によって作製されたクローンノックアウト細胞株を単離し、同定することです。一方の手法では非相同末端結合によって引き起こされるタンパク質ノックアウトを検出し、もう一方の手法では相同組み換え修復によって生成されたゲノム摂動を検出します。この手法は、遺伝的摂動を持つ細胞株の作製が遺伝子機能の解析における重要なツールとなる分子生物学の分野で特に有用です。

この手法の主な利点は、基本的な分子生物学的手法を用いて容易に実施でき、迅速かつ相対的にハイスループットな方法であることです。非相同末端結合（nonhomologous end joining）では小さな欠失または挿入が導入され、ドットイムノブロットによって評価されます。一方、相同組み換え修復（homology-directed repair）では、より大きく精密な摂動が可能であり、コロニーPCRによって評価されます。本実験では、10% FBSを添加したDMEM培地を用い、37 °C、5% 二酸化炭素条件下で培養したT-REx-293細胞を使用します。

トランスフェクションの前に、細胞を6ウェルプレートに播種し、未トランスフェクションのコントロール用のウェルを設けます。細胞を約70%のコンフルエンシーまで増殖させます。市販のトランスフェクションプロトコルに従い、2.5 microgramsの合計プラスミドを用いて細胞をトランスフェクションします。

選択マーカーを用いない細胞のトランスフェクションには、2.5 µgのCas9-sgRNAプラスミドを使用します。選択マーカーを用いる細胞のトランスフェクションには、0.75 µgのCas9-sgRNA1、0.75 µgのCas9-sgRNA2、および1 µgの相同組換えテンプレートを使用します。トランスフェクションした細胞および未処理のコントロールを、37 °C、5% CO2条件下で48時間インキュベートします。

選択マーカーを導入した細胞について、今回のケースではネオマイシンを用いて、適切な薬剤による薬剤選択を開始します。6ウェルプレートをインキュベーターに戻します。未導入のコントロール細胞がすべて死滅するまで、1日1回、処理した細胞を観察して細胞死の速度を確認します。

クローン集団を単離するために、まず選択後、元のウェルで細胞を100%コンフルエントまで増殖させます。次に、細胞を段階希釈し、細胞数をカウントします。完全なノックアウトを得るには、モノクローナルコロニーを適切に形成させることが不可欠であるため、目的の密度で細胞を播種するための適切な希釈倍率を慎重に決定する必要があります。

適切な希釈倍率が決定したら、1ウェルあたり0.33個の密度で細胞を96ウェルプレートに播種します。複数の正しいクローンを確実に単離するためには、3枚の96ウェルプレートに播種することから始めるのが適切です。2〜4週間にわたって、コロニーが目視で確認できるようになるまで観察します。

これらの代表的な画像は、成長の異なる段階にあるコロニーを示しています。播種時の単一細胞、5日目の細胞、および10日目に十分に形成されたコロニーです。滅菌済みのピペットチップを使用して、目視で確認できるコロニーを慎重かつ正確に採取し、単層成長を促進するために新しいウェルに再播種してください。

37 °C、5% 二酸化炭素条件下で細胞の培養を継続します。選択マーカーのないノックアウト候補は、ドットイムノブロットによりスクリーニングし、タンパク質産物をハイスループットに評価します。個々のクローンが 50～100% コンフルエントに達した後、ウェル内でピペッティングを行い、細胞の単層を剥離させます。

各ウェルの全量100 µLから90 µLを、清潔なマイクロ遠心チューブに分注します。本ビデオでは、2つのサンプルのみを処理します。6,000 RPMで5分間遠心分離し、培地を除去した後、10 µLの1X SDSローディングバッファーで細胞ペレットを溶解します。

ウェル内の残りの細胞に90 µLの新鮮な培地を加え、プレートをインキュベーターに戻して細胞の増殖を継続させます。細胞溶解液1 µLを乾燥したニトロセルロース膜上にピペットで滴下し、ドットを作成します。各サンプルを2枚の別々の膜に2回ずつブロッティングし、同一のサンプルパターンを2組作成します。

室温で、TBST溶液中の5%ミルクを用いてメンブレンを1時間ロッキングしながらブロッキングします。1時間後、推奨される一次抗体希釈倍率に従い、一次抗体および5%ミルク添加TBSTを用いてメンブレンを反応させます。一方のメンブレンには、本実験の標的タンパク質であるELAVL1に対する一次抗体を使用します。

もう一方のメンブレンには、変化しないことが予想されるコントロールタンパク質に対する一次抗体を使用します。ここではPUM2を使用しています。室温で1時間インキュベートします。各ブロットから一次抗体溶液を除去し、TBSTを加えて5分間インキュベートします。

このように、ブロットをTBSTで3回洗浄します。次に、各メンブレンに適切なHRP標識二次抗体を加え、室温で1時間反応させます。1時間後、メンブレンをTBSTで各5分間、3回洗浄します。

製造者の指示に従って化学発光基質溶液をブロットに塗布し、デジタル化学発光イメージャーでブロット膜を撮像します。最後に、適切なソフトウェアを使用して標的タンパク質およびコントロールタンパク質のドット強度を定量し、テキストプロトコルに記載されている方法で結果を解析します。選択性耐性マーカーを持つ候補は、コロニーPCRによってスクリーニングします。

まず、個々のコロニーを新しい96ウェルプレートに継代し、細胞ライセート調製のため、100%のコンフルエンスまで培養します。クローンの1セットから培地を除去し、各ウェルの細胞を市販のDNA調製キットの抽出バッファー30 microlitersで再懸濁し、清潔な1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。溶液を96 degrees Celsiusで15分間加熱し、その後、室温まで冷却します。

各マイクロ遠心チューブに30 µLの安定化バッファーを加え、十分に混ぜ合わせます。コロニーPCRによって野生型および単一アレルまたは二アレル変異株を同定するために、耐性カセットの組み込みの成否に基づいて、ホモロジーアーム周辺の領域を増幅する2組の独立したPCRプライマーを設計します。各側において、ホモロジーアームの外側にアニールする共通プライマーを使用してください。

野生型アレルを確認するには、共通プライマーと、ホモロジー領域にわたる内因性配列に相補的な対応するペアプライマーを使用します。目的の変異を確認するには、共通プライマーと、挿入した耐性カセットに相補的な別のペアプライマーを使用します。各検体について、細胞溶解液 0.5 µL、10X KOD buffer 1.25 µL、25 mM magnesium sulfate 0.75 µL、2 mM dNTPs 1.25 µL、フォワードプライマー 0.375 µL、リバースプライマー 0.375 µL、KOD polymerase 0.25 µL、および水 7.75 µLを含む反応混合液を調製します。

以下の条件でPCRを行います。まず95 °Cで2分間加熱し、続いて95 °Cで20秒間、プライマーの融解温度で10秒間、そして1 KBあたり20秒間の70 °Cというサイクルを25回繰り返します。その後、アガロースゲル電気泳動によりPCR産物を可視化します。非相同末端結合を用いたゲノム編集を行い、ELAVL1ノックアウト株を作製し、続いてドットイムノブロットによりELAVL1およびPUM2をプローブで検出しました。コントロール信号がほとんど認められなかったクローンにはX印を付け、以降の解析から除外しました。

ELAVL1シグナルが低いクローンをウェスタンブロッティングでさらに解析しました。確認された候補は緑色で、除外された候補は灰色で示されています。この図は、コントロールタンパク質に対するELAVL1シグナルの比率を昇順に示しています。

ほとんどの場合、ELAVL1の相対信号が最も低いクローナル集団が、ノックアウトとして正しく同定されました。相同方向修復法によって作製された候補個体はコロニーPCRでスクリーニングされ、PCR産物はアガロースゲル電気泳動により可視化されました。ここでは、内因性内部プライマーおよびノックアウト内部プライマーを用い、上流のインテグレーション接合部をまたぐプライマーを使用した際の結果例を示しています。

まず、親細胞およびバルクセレクト細胞の両方でプライマーの検証を行いました。24個の個別の候補クローンの結果を、野生型、ノックアウト、およびモノアレル欠損クローンの期待されるバンドパターンと共に示します。黒い矢印は正しい増幅産物を示し、星印はバイアレルノックアウトクローンを示しています。

バイアレル変異株の系統は、ウェスタンブロットによりさらに検証されました。非相同末端結合は、単一のCas9切断と選択に依存しないスクリーニングを用いるため、事前の準備をほとんど必要とせず、ドットブロットによるノックアウトクローンのスクリーニングによって、ノックアウトの生成が成功したかを迅速に判断できます。PCRベースのスクリーニングでは、相同組換え修復によって生成された大規模なゲノム摂動を伴う適切な候補者を正確に検出できます。

これらの手法により、分子生物学の研究者はノックアウトを容易かつ効率的に同定することができ、細胞株を用いて正常または機能不全の細胞プロセスを探索することが可能になります。このビデオを視聴することで、CRISPR/Cas9媒介ゲノム編集によって作製されたクローンノックアウト細胞株の分離および同定方法について、十分に理解することができます。