患者の膠芽細胞腫切除における細胞微小環境の定量的免疫組織化学
2017年7月31日
このプロトコールは、発色免疫組織化学およびImageJを用いたグリア芽腫患者切除における腫瘍微小環境成分を定量的に同定するために開発された。
このプロトコルの全体的な目標は、発色性免疫組織化学および画像J.This方法を使用して、膠芽腫患者切除における腫瘍微小環境成分を定量的に同定することですこれらの成分が患者サンプルでどのように見えるか、細胞の生理学的に関連する比率をどのように決定できるかなど、腫瘍微小環境分野での主要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、患者サンプルの分析が容易であることです。この手法の意味は、特徴が十分に示されていない複雑な神経膠芽腫腫瘍微小環境の解明にまで及びます。
一般に、この方法に不慣れな個人は、組織の過剰発達と飽和を防ぐために発色発生のタイミングを綿密に監視する必要があるため、苦労するでしょう。付属のテキストプロトコルで指定された洗浄を実行することにより、プロトコルを開始します。トリスベースの高pH抗原アンマスキング溶液と蒸留水を、メーカーの推奨値を使用して希釈します。
次に、希釈したマスキング解除溶液を非密封の電子レンジ対応容器に添加することにより、熱媒介抗原賦活化に移ります。スライドを容器に入れます。次に、容器のスライドを電子レンジに入れます。
次に、容器を高出力で20分間沸騰させます。蒸発のために液体レベルを監視し、必要に応じて容器に蒸留水を補充します。サンプルを溶液中で室温で1時間冷却します。
組織サンプルを疎水性で輪郭を描き、サンプルを覆うために必要な試薬の量を最小限に抑えます。次いで、十分な透過処理溶液をパイプでつなぎ、組織サンプルを覆うために100〜200マイクロリットルにする。溶液を取り出して廃棄し、組織サンプルを再び透過化溶液で覆います。
サンプルを室温でブロッキング溶液で1時間インキュベートします。次に、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を用いて、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、一次抗体宿主動物に対応する西洋わさびペルオキシダーゼポリマー試薬を使用して一次抗体を検出します。
組織サンプルを覆うのに十分な透過化溶液をパイプでつなぎ、サンプルを5分間インキュベートします。溶液を取り出して廃棄し、組織サンプルを透過化溶液でもう一度5分間覆います。スライドを0.3%過酸化水素とIX TBSで15分間インキュベートします。
ペルオキシダーゼジアミノベンジジンまたはdab基質を用いて、目的の染色強度が得られるまで2〜10分間サンプルを現像します。サンプルを対比染色して細胞核を同定します(例えば、ヘマトキシリンでメーカーのプロトコルに従います)。サンプルを100%エタノールとキシレンで脱水します。
最後に、サンプルを封入剤で永久にマウントします。私たちの腫瘍切除における 2 つの関心領域、原発腫瘍バルクと隣接領域は、主に拡散した浸潤がん細胞を持つ健康な組織で構成され、ヘマトキシリンとエオシンで染色された患者サンプルで神経病理学者と協力して特定されました。発色免疫組織化学により、各患者サンプル内のアストロサイト、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトの陽性染色が同定されました。
ネガティブコントロールとして一次抗体なしの染色を行いました。メーカーは、抗ALDH 1l1抗体のバックグラウンドを最小限に抑えた細胞体の最適な陽性染色とプロセスにより、1〜200の希釈に落ち着く前にさらに希釈することを推奨しました。画像Jを使用して、OSP-1陽性オリゴデンドロサイト染色のカバー率を定量化し、最終的に関心領域の違いを比較しました。
適切な閾値を画像に適用すると、閾値からのカバー率を測定し、複数の患者について比較することができます。膠芽腫またはGBM患者サンプルの5つの隣接領域およびバルク領域と健康な脳組織を比較し、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質1またはOSP1パーセントのカバレッジを比較しました。一度習得すれば、染色技術は1日目に4時間、適切に行えば2日目に2時間で行うことができます。
この手順を試みる際には、組織の染色強度と水分補給を注意深く監視することを忘れないようにすることが重要です。
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概要
本プロトコルでは、発色免疫組織化学染色とImageJを用いて、膠芽腫（グリオブラストーマ）患者の切除組織における腫瘍微小環境成分を定量的に同定する方法について解説します。この手法は、複雑な膠芽腫の腫瘍微小環境に関する知見を得ることを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 組織学
背景
- 膠芽腫は、極めて侵襲性の高い脳腫瘍です。
- 腫瘍微小環境は、腫瘍の進展において重要な役割を果たしています。
- この環境の組成を理解することは、標的療法の開発に不可欠です。
- 発色免疫組織化学染色により、組織構成要素の詳細な視覚化が可能になります。
研究目的
- 膠芽腫サンプルにおける腫瘍微小環境を定量的に評価すること。
- 異なる細胞型の生理学的に関連のある比率を決定すること。
- 患者サンプルのための簡便な分析手法を提供すること。
使用した手法
- 組織染色のための発色免疫組織化学染色。
- 定量解析用のImageJソフトウェア。
- メーカーの推奨に従った洗浄および抗原賦活化プロトコル。
- 発色時間の慎重なモニタリング。
主な結果
- さまざまな腫瘍微小環境成分の同定に成功。
- 膠芽腫サンプルにおける細胞比率を決定するための手法を確立。
- 膠芽腫微小環境の複雑性に関する知見。
- 患者サンプルに対する本手法の適用可能性を実証。
結論
- このプロトコルは、膠芽腫（グリオブラストーマ）の微小環境を研究するための信頼性の高い方法を提供します。
- 腫瘍微小環境内の相互作用の理解に役立ちます。
- 今後の研究では、これらの知見を基に膠芽腫の治療戦略を改善することが可能です。
よくある質問
産業界における実用性
患者由来の膠芽腫サンプルにおける腫瘍微小環境の定量分析により、神経腫瘍学の創薬におけるグリア細胞ターゲットのメカニズム的なリスク低減が可能になります。アストロサイト、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトの再現性のある領域特異的な測定値を提供することで、本手法は疾患に関連したシステムにおけるターゲットの検証および表現型スクリーニングをサポートします。これにより、微小環境の組成を治療反応および耐性メカニズムに関連付けることで、前臨床モデルにおける予測信頼性が向上します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲット検証
- 科学的価値：不均一な腫瘍領域内におけるグリア細胞の表現型およびその機能状態の解析を可能にする。
- 運用的価値：標的への結合（ターゲット・エンゲージメント）および微小環境の調節を評価するための、定量的な画像ベースのリードアウトを提供する。
- 予測的価値：患者サンプルにおけるグリア細胞の豊富さと病理学的勾配を相関させることで、バイオマーカーに即した標的選択を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：ハイスループットのイメージングおよび解析パイプラインに適合する、標準化された免疫組織化学プロトコルを確立します。
- 定量的な出力：ImageJを介してパーセント被覆率の指標を算出し、サンプル間および領域間の比較を可能にします。
- 再現性：発色反応の重要な時間制御を定義し、シグナルの特異性を確保し、バックグラウンドノイズを最小限に抑えます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：実際の患者切除サンプルを使用することで、ターゲット検証研究における病態生理学的忠実性を維持します。
- トランスレーショナルな連続性：グリア細胞組成の定量的ベンチマークを定義することにより、基礎研究での知見を前臨床モデルへとつなげます。
- リスク軽減：微小環境のコンテキストを特徴づけることで、グリア標的療法の生物学的リスク低減における不確実性を減少させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、標的仮説の検証からリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれるものであり、特に微小環境の調節に焦点を当てた神経腫瘍学プログラムに適しています。
- 探索生物学：ヒト組織におけるグリア細胞集団の空間的および定量的プロファイリングを可能にすることで、メカニズムの低リスク化を支援します。
- スクリーニング：微小環境の組成に対する化合物の影響を評価するために利用可能な、標準化され定量可能な染色パターンを生成します。
- 分析：閾値に基づいた被覆率測定を提供し、実験条件間での統計的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：グリア細胞密度を組織病理学的な関心領域に関連付けることで、バイオマーカー戦略に適合させます。
- エンタープライズでの再利用：神経膠腫およびその他の中枢神経系腫瘍モデルに適用可能な、転用可能なIHC/ImageJワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 患者サンプルにおける定量的かつ空間的に分解されたグリア細胞解析により、ターゲットへの信頼性を高めます。
- 運用上の価値： 抗原賦活化、ブロッキング、および発色時間の標準化プロトコルを通じて、再現性を向上させます。
- 戦略的価値： ターゲットの微小環境における相互作用の曖昧さを排除することで、go/no-go判断の精度を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 微小環境への関与データに基づき、グリア調節療法のリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- 免疫組織化学および神経病理学的サンプルの取り扱いに関する専門知識が必要である。
- 信号の飽和を避けるため、最適化された発色時間の管理に依存する。
- 一貫した定量化を行うため、標準化されたImageJのしきい値設定プロトコルが必要である。
- 関心領域（ROI）が注記された、患者由来の膠芽腫切除サンプルの入手が必要である。
- 組織の不均一性に制約があり、混在する信号を避けるために領域特異的な分析が必要となる。
