三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

この手順の全体的な目標は、3次元創傷関連フィブリン足場における細胞遊走に対する特定の対象治療の影響を観察することです。この方法は、ファイバーネットワーク構造の変化が細胞移動にどのように影響し、創傷部位のフィブリン血栓に、この技術の主な利点は、フィブリン血栓内の細胞移動を3Dで分析するためのシンプルで再現性のある方法を提供することです。一般的に、この方法に不慣れな人は、スフェロイドの移植が難しい場合があるため、苦労します。

まず、凍結新生児ヒト真皮線維芽細胞のバイアルを摂氏37度の水浴で温めます。細胞が解凍されたばかりの場合は、遠心分離によって細胞を収集し、ペレットを新鮮な新生児ヒト皮膚線維芽細胞培地に1 x 10〜6 mLの濃度で再懸濁します。次に、T75培養フラスコに細胞を播種し、摂氏37度と二酸化炭素5%で72時間インキュベートします。

培養物が80%のコンフルエント度に達したら、5ミリリットルのトリプシンEDTAで細胞を剥離します。摂氏37度で5分後、温めた培地の5ミリリットルでトリプシンを中和し、1:1の比率でトリパンブルーと細胞の40マイクロリットルを混合します。カウントのために10マイクロリットルの細胞アリコートを予約します。

遠心分離により細胞を回収し、ペレットを1.25×10で5細胞/ミリリットルの濃度に再懸濁します。次に、10センチメートルのシャーレの底に5ミリリットルの滅菌PBSをプレートします。次に、ペトリ皿の蓋をひっくり返し、蓋の内面に細胞懸濁液の20マイクロリットルの滴を複数追加します。

すべての滴を配置したら、吊り下げられた滴が外れないように注意しながら、蓋を皿に再度反転させ、皿を摂氏37度のインキュベーターに72時間静かに置きます。インキュベーションの最後に、1ウェルあたり100マイクロリットルの血栓溶液をウェルあたり100マイクロリットルの血栓溶液を48ウェルプレートに加え、プレートを静かに振って軽くたたいて、フィブリン血栓混合物がウェル全体をコーティングするようにします。プレートをインキュベーターに1時間置きます。

凝血層が重合したら、ハンギングドロップ培養物中のスフェロイドの存在を光学顕微鏡で確認し、48ウェルプレートとハンギングドロップ培養皿を細胞培養フードに移します。ペトリ皿の蓋を慎重に反転させて吊り下げ式の液滴培養物にアクセスし、21ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器を使用して、1滴をコーティングされた各フィブリンに1滴を移します。スフェロイドの吸引とめっきには、プロセスの中で最も困難で重要なステップがスフェロイドを破壊せずに移植することであるため、私は特に注意を払います。

顕微鏡でプレートを検査し、スフェロイドが適切なウェルに適切に播種されていることを確認します。調製したばかりの100マイクロリットルの血栓溶液を液滴を含む各スフェロイドに穏やかに重ね、顕微鏡下でスフェロイドを再検査して、スフェロイドがまだ無傷で各ウェルの中心にあることを確認します。次に、48ウェルプレートをインキュベーターに戻し、フィブリンの2番目の層を重合させます。

1時間後、各ウェルを対応する実験用スフェロイド群に適した500マイクロリットルの培地で処理し、プレートを摂氏37度のインキュベーターに戻します。24時間から72時間ごとに明視野顕微鏡でスフェロイドの画像を取得し、zスタックを使用して3D細胞培養の連続した断面を表示します。次に、適切な画像解析ソフトウェアで、連続する各時点における各スフェロイドの細胞境界をトレースし、測定機能を使用して各スフェロイドの面積の増加率にアクセスします。

それらの培養に続いて、目的の遊走促進剤または抗遊走剤において、スフェロイドの初期領域を明視野顕微鏡イメージングによって決定し、各連続した時点におけるスフェロイド体からのその後の細胞増殖の程度を決定するための基準として使用することができる。この代表的な実験では、遊走促進剤に曝露されたスフェロイドは、遊走抑制剤または制御剤に曝露されたスフェロイドと比較して、元のスフェロイド体から離れる移動の程度が有意に増加したことを示しました。逆に、抗移動剤に曝露されたスフェロイドは、対照処理されたスフェロイドと比較して、元のスフェロイド体からの移動の程度が有意に減少した。

一度習得すると、この技術は、適切に実行されれば、細胞培養時間を除いて2時間半で完了することができます。このビデオを見れば、3次元in vitro細胞遊走アッセイのための細胞スフェロイドの培養方法と埋め込み方法について十分に理解できるはずです。この手順に続いて、組織学的および免疫組織化学などの他の方法を実行して、血餅内のフィブリンネットワーク構造またはスフェロイド細胞内のアクチンアライメントが細胞遊走の増加または減少にどのように対応するかについての追加の質問に答えることができます。

細胞培養や針の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、適切な保護具を着用し、滅菌培養フードで作業するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。