同所性同種肺がん細胞生着の効率を高めるブレオマイシンとマウスの気道をプレコンディショニング

この手順の全体的な目標は、腫瘍を開始する肺がん細胞をマウスの気道に移植する効率を高めることです。この方法は、薬剤耐性の原因や線維症と肺がんとの関係など、がん生物学における重要な疑問に答えるための新しい前臨床モデルを確立するのに役立ちます。この技術の主な利点は、さまざまなマウス系統の肺への腫瘍開始細胞の移植効率が向上することです。

この技術の意味は、治療に対して異なる臨床反応を示すことが知られている、より多様なヒト肺がんのサブタイプをモデル化することを可能にするため、治療にまで及びます。このプロトコルでは、最初にマウスにブレオマイシンを注射する必要があります。その後、14日後に腫瘍細胞を注入します。

両方の注射の手順は非常に似ており、ここで説明します。注射の2時間前に、ブレオマイシンストックを氷上で解凍し、使用濃度まで希釈します。氷の上に置いてください。

細胞ボーラスの場合、テキストプロトコルに記載されているように細胞懸濁液を調製してください。各マウスの処置時間は、全部で約10分です。つま先をつまんで適切な麻酔を確認し、獣医の軟膏を目に塗ってください。

このとき、マウスの毛が黒い場合は、肋骨の腹側と背側の両方を剃り、正しく画像化できるようにします。次に、マウスを前歯で固定し、マウスをプラットフォームに背を向けて挿管プラットフォームに置きます。細胞ボーラスを注入する場合は、穏やかなトリチュレーションで今すぐ再懸濁します。.

次に、胸の上部を照らし、口を開けて、平らな鉗子を使用して舌をそっと引き出します。針を取り外して気管用のIVカテーテルを準備し、気管開口部の上に配置します。次に、カテーテルの上部が前歯に近づくまでカテーテルを気管に挿入し、カテーテルの内部を照らして配置を確認します。

次に、50マイクロリットルの新しくできたブレオマイシンまたは細胞懸濁液をカテーテルに直接分注します。ボリューム全体がカテーテルを下って移動するまで数秒待ちます。その後、カテーテルを取り外し、10%漂白剤で廃棄します。

マウスが液体を吸い込んでいない場合は、マウスの呼吸を注意深く監視し、カテーテルの位置を調整します。マウスの呼吸が止まった場合は、すぐにカテーテルを取り外し、マウスが呼吸するのを待ってから、カテーテルを再挿入します。カテーテルを抜去した後、5匹の治療マウスを麻酔したまま、画像化の準備を整えるために手順を続けます。

回復のためには、マウスをIACUC承認の回復ケージ内の加熱パッドに仰臥位で置き、完全に回復するまで監視します。細胞を注入してから2〜3分後、インスリン針を使用して、100マイクロリットルのルシフェリンを眼窩後向きに注入します。イメージングセッションごとに注射に使用する眼を交互に行います。

少なくとも2分間待った後、動物生物発光イメージャーで最大5匹のマウスを胸骨横臥位に配置し、発光設定を使用して背側画像を取得します。コントロールパネルの下で、解像度と感度の設定を調整して、細胞の発光を測定します。ほとんどのアプリケーションでは、3分から始めて、ビニングを中に設定し、f /ストップを1に設定し、視野をdに設定し、被写体の高さを1.5に設定します。

注射が成功した場合、片方の肺または両方の肺の胸部上部で信号が検出されます。細胞が気管の入り口に集まっている場合、注射は成功しませんでした。背側画像を撮影した後、マウスを反転させて腹側画像を取得し、必要に応じて設定を調整します。

イメージング後、テキストプロトコルに記載されているように術後ケアを進めます。次に、このイメージングプロトコルを生着の3日後に繰り返し、その後毎週繰り返します。画像を解析するには、生物発光解析ソフトウェアを使用します。

まず、シリーズ内の適切な画像をすべて読み込みます。このセクションでは、1つのソフトウェアパッケージについて詳しく説明します。次に、各マウスについて、シリーズの最初の画像で、正方形の関心領域を作成し、肺領域全体をカバーする胸の上部領域上に配置します。

次に、右クリックを使用してすべての関心領域をコピー機能にアクセスし、このツールを使用して、グループ内の各画像に同じ関心領域を適用します。次に、各画像内で、各マウスの上部胸を覆うように正方形の位置を微調整します。これは、腹側と背側の両方のビューに対して行います。

次に、画像ウィンドウの左上隅で、フォトン関数を選択します。次に、測定オプションを選択します。その後、関心領域のデータは、全流束として出力テーブルに表示されます。

必要に応じて、このデータを分析します。免疫力が低下した場合、無腸性マウスをブレオマイシンで治療しました。細胞ボーラス生着の前に、ブレオマイシンで治療されたマウスでは14日目までに一過性の線維化が観察されましたが、ビヒクルで治療されたマウスでは観察されませんでした。.

次に、確立されたヒト肺がん細胞株H2030の細胞を、これらのマウスの肺に気管内導入しました。35日後、ブレオマイシンで治療したマウスは肺腫瘍の負荷が高かった。しかし、ビヒクルで治療した動物では、腫瘍は検出されませんでした。

肺腫瘍の負荷は組織学を用いて確認された。ビヒクルで前処理された肺には腫瘍結節の証拠がありませんでしたが、ブレオマイシンで前処理された肺には大きな腫瘍結節がありました。転移性H2030 BrM 3細胞株を移植した後、39〜57日までに、生物発光が強すぎてイメージングできなかったため、転移は遠隔臓器でex vivoで分析されました。

小さな病変はさまざまな組織で検出される可能性があり、この方法が自然播種性疾患を研究するために有望であることを示唆しています。この手法を習得すると、イメージングなしで5匹のマウスのケージあたり10分、マウスをイメージングする場合はケージあたり20分で行うことができます。この手順を試みるときは、カテーテルの適切な挿入を確認し、動物の呼吸を監視することを忘れないでください。

この手順に続いて、薬理学的研究や採取した組織のアミノ酢酸化学などの他の方法を実行して、生着腫瘍が薬物にどのように反応するか、または肺に特異的な腫瘍間質相互作用を特徴付けるなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、生理学的に関連性のある環境での患者由来の異種移植片を含む、さまざまなマウス系統や腫瘍モデルに適用できます。ブレオマイシンの取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、バイオハザードフードの操作や適切な廃棄などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。