慢性的な刺激の収縮活動に伴うラット骨格筋の表現型適応を研究への応用

運動の慢性収縮性活動モデルは、in vivoでの運動トレーニング刺激に対する骨格筋の適応を研究するのに役立ちます。特に、このモデルは、6週間のトレーニングプロトコルの表現型適応を7日以内に引き出します。この方法は、ミトコンドリアの生合成、オートファジー、その他多くの運動に関連する細胞適応など、筋肉生理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、数か月を必要とする他の運動トレーニングプロトコルと比較して、7日間の短い時間コースで筋肉特異的な適応を観察できることです。この技術の意味は、慢性的な筋肉刺激が加齢に伴う筋力低下の改善に効果があることが示されているため、筋萎縮年齢の治療にまで及びます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、一般的な腓骨神経をランドマーク化し、両端に電気コイルを取り付けるのが難しいため、苦労するでしょう。

まず、酸素を含む1〜3%イソフルラン吸入でラットに麻酔をかけ、後肢のつま先のピンチに対する反応を確認し、呼吸の深さと速度を観察することにより、完全な鎮静を確認します。乾燥を避けるために眼に眼用潤滑剤を塗布し、ラットを低から中程度の設定の加熱パッドに置きます。.左後肢をそっと剃り、首の後ろから胴体の周り、前肢の後ろ、前胸部を横切るストリップを剃ります。

削った部分をヨウ素とエチルアルコールでやさしく拭いて消毒します。動物がうつ伏せになっている状態で、10番の刃が付いた滅菌メスを使用して、剃った領域の中央にある首の後ろに約0.5センチメートルの小さな切開を行います。次に、動物を右側に転がし、膝関節のくぼみの間と尾の原点に近い左後肢の皮膚に2〜3センチの切り込み

先端が鈍く湾曲した手術用ハサミを使用して、皮下領域を約3.5〜4センチメートルに解剖し、皮膚とその下の筋肉を分離して、開いた皮膚とその下の筋肉との間にポケットを作ります。次に、手術用ハサミを使用して、大腿二頭筋の筋肉に0.5センチメートル未満の小さな切開を行い、ハサミの先端が筋肉を直接切り込むようにします。次に、内部の筋肉群と総腓骨神経が見えるまで、切断領域を静かに開きます。

神経を切ったり損傷したりしないように細心の注意を払ってください。次に、50〜60センチのPTFEコーティングされた細いステンレス線を用意し、半分に折ります。ワイヤーの折り畳み部分を30センチのステンレス鋼棒のスリットに引っ掛けます。

ロッドを使用して、ワイヤーを後肢の開いたポケットに通し、脚を上り、背中の中央に沿ってL字型に通し、首の後ろの小さな切開領域に到達します。窓のサイズが窓の中央に横たわっている状態で窓のサイズが約1.5平方センチメートルになるまで、金属製のリトラクターで窓を引っ張って開きます。メスを使用して、ワイヤーの端を慎重に1.5センチ剥がします。

剥がしたワイヤーの端を鈍い21ゲージの針に5回巻き付けてコイルを作ります。コイルが適切に作られたら、針をコイルから離します。コイルの一番端に結び目を作り、コイルが神経から1.5〜2.5ミリメートル離れていることを確認して、神経の左側で縫合します。

コイルを固定するには、コイルに沿って2つまたは3つの縫合糸を追加で適用します。このステップでは、神経と基礎となる筋肉の損傷を避け、すべての動物で一貫した刺激条件を達成するために、かなりの練習と忍耐が必要です。研究中にすべての外科的処置を完了するために、1人の熟練した研究者がいるのが最善です。

抗生物質溶液を2〜3滴塗布し、サイズ5-0のシルクを使用して窓を慎重に縫合します。残りのワイヤーのたるみを緩く巻き、股関節の上の大腿二頭筋の縫合切開部の上の皮下ポケットに押し込みます。抗生物質溶液を2〜3滴塗布し、ホチキス止めして開いた皮膚を閉じます。

次に、動物を胸骨の位置に移動し、首の上部にある切開部から出ているワイヤーループを切断して、2つのワイヤー端を作成します。メスを使用して、ワイヤーの端を0.5センチメートル剥がします。ほつれたワイヤーを切断します。

ワイヤーの剥がれた部分をピンソケットの穴にゆっくりと押し込み、はんだごてを使用して、ピンソケットにワイヤーをはんだ付けします。ピンで接続されたワイヤーの端を4.4センチメートルの滅菌ガーゼパッドに通します。次に、刺激装置ボックスのベースの穴にワイヤーを通します。

CCAユニットの接続ソケットにピンを差し込みます。粘着性の鋲を使用してCCAユニットをチャンバーにそっと入れ、CCAユニットをチャンバーの底に固定します。アスレチックテープまたは多孔質の外科用テープを使用して、剃った胴体の周りのチャンバーを固定します。

チャンバーの上部を3層のテーピングで閉じます。そして、刺激装置ボックスの側面にテープを巻き付けてボックスを固定して仕上げます。ポータブル赤外線ストロボライトから放出される赤外線の単一パルスにユニットをさらして、CCAが機能しているかどうかを確認します。

CCAが適切に機能している場合、後肢の筋肉は赤外線に反応して収縮します。CCA手順を開始する直前に動物の体重を量り、ベースライン測定値を記録して、CCA手順後の体重の変化による重度のストレスや悪影響を特定するのに役立ちます。CCA刺激の日には、刺激装置ユニットをポータブル赤外線ストロボライトによる赤外線の単一パルスにさらしてCCAをオンにし、10ヘルツCCA刺激を3時間または6時間加えます。

30〜60分ごとに刺激と動物を確認してください。希望のCCA期間が経過したら、赤外線を照射してCCAユニットの電源を切ります。1日6時間のCCAを7日間投与したラットは、刺激を受けていない反対側の後肢と比較して、刺激された筋肉のミトコンドリア生合成が促進されました。

このミトコンドリア生合成の増加は、PGC-1αのタンパク質発現の増加によって示されます。ミトコンドリアの呼吸能力を測定するための透過性筋線維の検査により、CCAは制御筋に対する筋肉の最大呼吸能力の増加をもたらしたことが明らかになりました。サルコレンマ下ミトコンドリアと筋間ミトコンドリアの集団は、CCAの7日間後に、対照群の非刺激筋肉と比較して増加しました。

オートファジーおよびリソソームシステムへの適応もCCAによってもたらされます。リソソーム生合成の主要な調節因子である転写因子EBのタンパク質量の増加は、CCA後、すべての時点で観察されます。この手順に続いて、一般的な皮下注射や腹腔内注射などの他の方法を実行して、コルヒチン治療によるオートファジーフラックスの推定などの追加の質問に答えることができます。

このビデオを見た後、持久力トレーニング後の筋肉表現型の変化を調べるために、現在の慢性収縮活動モデルをどのように適用するかを十分に理解しているはずです。