循環腫瘍細胞を取り込むため医療用ワイヤー線を用いた腫瘍細胞の特性解析: 蛍光抗体法や DNA 魚に基づく 3 D アプローチ

このプロトコールの全体的な目標は、免疫蛍光染色と3D官能基化ワイヤー上のDNA蛍光in situハイブリダイゼーションを組み合わせ、従来の広視野蛍光顕微鏡を使用して支持体上の免疫表現型とFISHシグナルを同定することです。この方法は、循環する非小細胞肺がん細胞の治療関連標的の特定など、腫瘍細胞の分泌特性評価の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。このプロトコルの主な利点は、EpCAM陽性などの表現型パラメータとARC遺伝子状態などの細胞質変化を同時に同定して、推定CTCを検出できることです。

この方法は、in situインスリンがんのCTC機能を提供するために独自に設計されましたが、乳がんなどの他のがんの研究にも適用できます。このプロトコルは、直接免疫表現型検査とCTC検出用のワイヤーを取り扱いながら開発されました。より多くのデータを得るために、イムノフェノタイピングプロトコルをDNA蛍光in situハイブリダイゼーションプロトコルに関連付けました。

ワイヤーの取り扱いは、主に機能化された先端が壊れやすいため、容易ではありません。視覚的なデモンストレーションでは、読者が手順を再現します。実験を開始するには、4ミリリットルの完全培地を使用して、5ミリリットルのバイアルに80%の合流点にあるT75フラスコの内容物全体を再懸濁します。

次に、ガラスパッケージからワイヤーを取り出します。ワイヤーの官能化された金部分をバイアルに浸し、ワイヤーストッパーが5ミリリットルのバイアルに水密にフィットすることを確認します。ワイヤーを実験用フィルムで密封します。

次に、チューブローテーターでワイヤーを室温で30分間インキュベートします。回転後、3つの異なる清潔なバイアルを使用して、1折りPBS溶液でワイヤーを3回すすぎ、ワイヤーが乾くのを待ちます。フード内でワイヤーを10分間風乾した後、ワイヤーを5ミリリットルチューブの100%アセトン溶液に室温で10分間浸して細胞を固定します。

官能基化された先端に微量のアセトンがないことを確認してください。ワイヤーを室温で5分間風乾します。次に、5ミリリットルのチューブで、ワイヤーを1つ折りPBSで2回洗います。

ワイヤーを抗体希釈バッファーでインキュベートします。150 μLの抗体混合物を、蛍光色素と蛍光色素で結合したモノクローナル一次抗体の希釈液と、データシートに記載されている抗体希釈バッファーを調製します。次に、P200チップを使用してワイヤーストッパーからワイヤーを引き出し、チップの大きい方の穴にワイヤーをそっと挿入します。

機能していない端を最初に挿入し、金色の部分が大きな穴のすぐ後ろに来るまで、ワイヤーを小さい方の穴からゆっくりと引っ張ります。150マイクロリットルの抗体ミックスをチップに静かに加えます。気泡形成のリスクを避けるために、機能化された端が完全に沈むまでワイヤーをゆっくりと回転させます。

先端の穴を塞ぎ、穴の周りに実験用フィルムを巻き付けます。ワイヤーを4°Cの暗闇で一晩垂直にインキュベートします。2日目は、ワイヤーを1つ折りPBSで2回洗浄し、抗体のインキュベーションをブロックします。

ワイヤーをワイヤーストッパーに再度挿入します。DNA-FISHプロトコルの3時間前に、ハイブリダイゼーションオーブンを摂氏75度に設定し、乾熱オーブンを摂氏37度に設定します。0.4倍SSC溶液を摂氏4度に冷却します。

氷冷した0.4倍SSC溶液でワイヤーを3回洗浄します。ヒュームフードの食器棚の下の暗闇でワイヤーを10分間乾かします。10分後、プローブを渦巻き、5秒間回転させます。

プローブの10マイクロリットルをガラスマイクロチューブに落とし、実験用フィルムで覆います。マイクロチューブを乾いた吸収紙で包みます。50ミリリットルのチューブに入れ、短時間回転させます。

乾燥させたワイヤーをマイクロチューブに慎重に入れ、ワイヤーストッパーを挿入します。次に、ワイヤーストッパーをゴムセメントで密封します。ハイブリダイゼーションオーブン内の暗く湿ったチャンバーにワイヤーを75°Cで8分間入れて、完全なDNA変性を得る。

8分後、湿ったチャンバーを摂氏37度の乾熱オーブンに一晩移します。0.4倍SSC溶液を入れたスライド染色ジャーを、摂氏72度に設定したウォーターバスに入れます。0.4倍のSSC溶液の温度を、摂氏72度またはマイナス1度に達するまで確認します。

次に、ガラスビーカーを2つ用意します。1つは2倍SSCと0.05%Tween溶液、もう1つは蒸留水です。乾熱オーブンの湿ったチャンバーを取り外します。

ピンセットを使用して、ワイヤーストッパーからゴムセメントを慎重に取り除き、コーティングされていないワイヤーの端をエンドストッパーに通して引っ張ります。ワイヤーを0.4倍SSC溶液に72°Cで2分間浸します。ワイヤーを2つ折りSSCと0.05%Tween溶液で室温で30秒間洗浄します。

次に、室温の蒸留水でワイヤーを洗浄します。ヒュームフードの下のワイヤーを暗闇で10分間乾かします。官能基化されたワイヤーの先端を、あらかじめ調製したDAPI溶液と2ミリリットルのバイアルでインキュベー

ワイヤーを1つ折りPBSで2回すすぎ、ワイヤーを風乾します。ワイヤーをワイヤーホルダーにセットし、機能化されたチップを特殊ホルダーのエントリーポイントに慎重に挿入し、チップが結合点と一致するようにします。特別なホルダーを顕微鏡ステージに置きます。

20倍レンズを使用して顕微鏡の焦点を調整します。まず、特殊なサポートに大まかに焦点を合わせ、次にDAPIチャネルで明るく見えるセルを微調整します。レンズの中心にあるセルのみに焦点を合わせ、12ビットデジタルカメラを使用して20倍および40倍の対物レンズを使用し、赤、緑、青のプローブに適切なフィルターを使用して画像を取得します。

最後に、機能化された先端の隣にワイヤーを詰めて長期保存用のワイヤーを準備し、ワイヤーをガラス管に慎重に挿入します。ワイヤーは垂直または水平にマイナス20°Cで保管してください。免疫蛍光染色はDNA-FISHシグナルに干渉しませんでした。

3D担体官能基化ワイヤーで免疫DNA-FISHアッセイを行ったところ、EpCam染色がはっきりと見えました。ALKプローブにより、遺伝子の欠失が明らかになりました。NCI-H3122細胞株は、野生型ALKGのNCI-H1975とは対照的に、異常なLAK遺伝子の状態を示しました。

このプロトコルを習得すれば、3日間で合計9時間の作業で完了することができます。この手順を試みるときは、損傷を防ぐために、ワイヤーの機能化された部分に触れないことが重要です。このプロトコルに従って、他の表現型マーカーを持つ細胞の同定や、NATやHAR2遺伝子増幅などの他の細胞遺伝学的変化などの追加の質問に答えるために、さまざまな抗体とFISHプローブを使用することができます。

このビデオを見れば、EpCAM陽性率などの表現型パラメータを通じて同時に推定されるCTCを同定する方法や、ARC遺伝子の状態などの細胞遺伝学的変化を検出する方法について、十分に理解できるはずです。アセトンとオーブンでの作業は非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行するときは、フード内のアセトンの取り扱いや保護手袋の着用などの予防措置を常に講じる必要があります。