化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

HEVナノ粒子の表面を化学的に機能化させる全体の目的は、診断および治療目的で、標的となる免疫原性分子、治療分子、および診断分子をHEVナノ粒子の表面に結合させるための、再現性および一貫性のある手法を提供することです。

この手法は、がんへのターゲティングの強化やナノ治療薬の分布をどのようにモニタリングできるかといった、ナノメディシン分野における重要な課題への回答に寄与します。この技術の主な利点は、遺伝子工学的な手法と比較して、再現性が高く効率的であり、はるかに容易に達成できる点にあります。

手順の実演は、当研究室のリサーチアシスタントであるMichelle NguyenとIvan Ruizが行います。

テキストプロトコルに記載されているE型肝炎ウイルスナノ粒子の作製および精製から、本プロトコルを開始してください。

TEM観察のため、HEVナノ粒子試料を10 mM MES（pH 6.2）を用いて0.5から2 mg/mLに希釈します。カーボンコートグリッドを40 mAで30秒間グロー放電処理し、親水性のカーボン表面を作成します。グリッドの親水性表面は、グロー放電処理後30分間しか維持されません。イオン化後、グリッドとピンセットを保持し、HEVナノ粒子試料を2 µLグリッドに滴下します。

15～30秒後、フィルターペーパーでグリッドをブロットします。次に、直ちに二回蒸留水でグリッドを洗浄し、再びフィルターペーパーでブロットします。直ちに2%ウラニル酢酸を2 µL、グリッドに滴下します。15秒後、フィルターペーパーでグリッドをブロットします。サンプルグリッドを電子除湿ドライキャビネットに入れ、一晩置いて乾燥させます。

サンプルによっては、構造の可視化および特性評価にクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）が必要となる場合があります。グリッドをTEMに導入し、10〜80Kの倍率で観察します。HEVナノ粒子は、ウイルスRNAが存在しないため、TEMでは直径約27 nanometersの空の正二十面体タンパク質として観察されます。

HEVナノ粒子とマレイミド結合ビオチンのワンステップ結合を行うには、まずHEVナノ粒子をミニ透析ユニットに適用します。製造元のプロトコルに従い、0.01 molar PBS pH 7.4を用いて室温で1時間、ナノ粒子の透析を行います。透析後、HEVナノ粒子を1.5 milliliterチューブに移し、分光光度計を用いて280 nanometersにおけるタンパク質濃度を測定します。1 mg/mLのナノ粒子に、100 micromolarマレイミド-ビオチンと0.01 molar PBS pH 7.4を等量ずつ混合し、モル比を1:5にします。4 °Cで一晩反応させた後、製造元のプロトコルに従い、スピン脱塩カラムの手順で未結合のマレイミド-ビオチンを除去します。標準的な還元SDS-PAGEを用いてサンプルを分析します。

標準的な手順に従い、HRP標識ストレプトアビジンを用いて化学発光ウェスタンブロットを行い、X線フィルムで化学発光シグナルをキャプチャします。

乳がん細胞特異的リガンドLXY30をHEVナノ粒子の表面に露出したシステインに2段階で結合させるには、まずナノ粒子を小型透析ユニットに入れ、室温で0.01 M PBS pH 7.4に対して1時間透析します。次に、HEVナノ粒子を1.5 mLチューブに移し、分光光度計を用いて280 nmでのタンパク質濃度を測定します。続いて、650 µMのマレイミド-アジドと650 µMのアルキン-LXY30を、200 µMの硫酸銅および1 mMのアスコルビン酸と混合します。これにより、650 µMのマレイミド結合LXY30が形成されます。この混合物を4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、1 mg/mLに調整したHEVナノ粒子に、1:3のモル比になるよう約10%容量のマレイミド結合LXY30を混合します。4 °Cで一晩反応させます。マレイミドLXY30の濃度が比較的高いため、混合後の硫酸銅などの反応物の最終濃度は約10分の1に減少します。H型肝炎ウイルスナノ粒子への損傷を避けるための別の選択肢として、銅フリーの結合法があります。

メーカーのプロトコルに従い、スピン脱塩カラムを用いて未結合のマレイミドクリックLXY30を除去します。LXY30結合HEVナノ粒子は4 °Cで保存してください。LXY30 HEVナノ粒子とCy5.5蛍光タグのワンステップ抱合を行うには、まず1 mg/mLに調整したLXY30結合ナノ粒子に、モル比が1:5となるよう同量のCy5.5蛍光タグを混合します。混合液を4 °Cで一晩反応させた後、メーカーのプロトコルに従い、スピン脱塩カラムの手順で未結合のCy5.5 NHSを除去します。LXY30 Cy5.5結合HEVナノ粒子は4 °Cで保存してください。

腫瘍細胞標的に向けたHEVナノ粒子のLXY30機能化において、2つの方法を試みました。まずHEV 573Cナノ粒子をマレイミド・アジドに結合させ、次いでLXY30アルキンとのクリック化学反応を行ったところ、TEM観察においてHEV 573Cナノ粒子が崩壊しているように見えました。しかし、最初にLXY30-アルキンとマレイミド-アジドの間でクリック化学反応を行い、マレイミド結合LXY30を形成させた後、これを修飾済みHEVナノ粒子に接合させる方法では、構造に影響はなく、HEV 573Cナノ粒子は元の形態を維持していました。LXY30およびCy5.5結合HEVナノ粒子を培養した乳がん細胞に適用し、共焦点顕微鏡で観察しました。共焦点顕微鏡による近赤外蛍光画像から、LXY30 Cy5.5結合HEVナノ粒子は、Cy5.5結合HEVナノ粒子と比較して、MDA MB-231乳がん細胞に対してより高い結合親和性を持ち、細胞内への取り込みが増加していることが示されました。

この手法の意義は、正常細胞に損傷を与えることなく、腫瘍の正確な標的化および診断を可能にするマルチモーダル標的化および治療分子の検討にまで及びます。本手法は、化学的な表面修飾を通じて癌および腫瘍の標的化に関する知見を提供できるだけでなく、癌の早期診断、スクリーニング、およびイメージング誘導治療にも適用可能です。