天然化合物の存在下でそのまま β 細胞のミトコンドリア機能を測定するための高解像度の呼吸

このアプローチの全体的な目標は、インスリン刺激条件下で、膵臓ベータ細胞の呼吸機能を直接評価することです。これは、ベータ細胞の呼吸機能に対するさまざまな化合物の影響を観察するためにも使用できます。この方法は、特定の化合物が呼吸の変化を介して膵臓ベータ細胞の機能に影響を与えるかどうかなど、膵臓ベータ細胞生理学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、基礎およびインスリン刺激条件下で、膵臓ベータ細胞の呼吸機能を直接評価するために使用できることです。細胞調製と呼吸の測定には精度が必要なため、細胞調製と機械の使用手順を学ぶのが難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。まず、INS-1由来の832/13ベータ細胞を補充したRPMI 1640で培養します。

2ミリリットルの0.25%トリプシンを加え、摂氏37度で10分間インキュベートすることにより、T75フラスコから細胞を取り出します。次に、完全なRPMI 1640培地を8ミリリットル追加してトリプシンを中和します。細胞体積の100マイクロリットルを900マイクロリットルのPBSで希釈し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。

次に、10cmの皿に1ミリリットルあたり100万個の細胞の密度で細胞を播種します。加湿インキュベーターで37°C、5%CO2で細胞を培養してから、呼吸実験を始めてください。832/13細胞を37°C、5%CO2の加湿インキュベーターでプレーティングし、培養してから24時間後に培地を交換してください。

次に、ビヒクルコントロールまたはカカオ由来のエピカテキンモノマーで細胞を処理し、最終濃度を100ナノモルにします。加湿インキュベーターでさらに24時間、摂氏37度、5%CO2で培養による処理を加えます。次に、1x Low Glucose Secretion Assay Buffer(SAB)で細胞を5分間洗浄します。

バッファーを吸引し、1x 低グルコースSABで細胞を3時間インキュベートし、1時間ごとにバッファーを交換します。インキュベーション後、1ミリリットルの0.25%トリプシンで細胞を皿から取り出します。車両制御で処理された皿からのトリプシン中の細胞を、15ミリリットルの円錐管内の4ミリリットルのSABと組み合わせます。

同様に、目的の化合物で処理された皿を緩衝液と組み合わせます。細胞体積の100マイクロリットルを900マイクロリットルのPBSで希釈し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞体積の100マイクロリットルを900マイクロリットルのPBSで希釈し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。

データは、ミリリットルあたり100万個の細胞の濃度が最も効果的であることを示しています。テキストプロトコルに詳述されているように高解像度呼吸計を調製した後、各オキシグラフチャンバーに2.4ミリリットルの1x低グルコースSABバッファーを追加します。チャンバー内のマグネチックスターバーを使用して、750rpm、摂氏37度でバッファを連続的に攪拌し、データ記録間隔は2.0秒です。

これを行うには、F7 ボタンを選択し、システムというラベルの付いたタブを開きます。プランジャーを奥まで押し込み、レンチエアレーション設定まで引っ込めます。安定した酸素流束が得られるまで、機械を最低1時間平衡化させます。

次に、実験期間中、マシンを摂氏37度に設定します。F7ボタンを押して、Oxygen O2とラベル付けされたタブを開き、分極電圧を800ミリボルトに2のゲインで設定します。酸素濃度の変化が安定するまで、SABバッファーの酸素濃度を少なくとも30分間平衡化します。

次に、酸素濃度の変化が安定している領域を選択し、Shiftキーを押しながらマウスを左クリックし、選択した領域をマウスでドラッグして、酸素濃度の変化のバックグラウンド測定を確立します。選択した領域に関連付けられた文字をクリックし、2 つのチャンバーのそれぞれに対応する各トレースの文字を R1 に変更します。画面の左下隅と右下隅にあるO2キャリブレーションボックスをダブルクリックします。

エアキャリブレーションをR1として選択マークボタンをクリックし、次に両方のチャンバーのキャリブレーションとクリップボードへのコピーを選択します。次に、各チャンバーに2.4ミリリットルのサンプルをロードし、1つのチャンバーに制御ビヒクル処理細胞を、1x低グルコースSABに化合物処理細胞を1チャンバーにロードします。プランジャーを完全に押し込み、残留量を吸引します。

実験全体を通して、750 rpmおよび37°Cで細胞を連続的に攪拌します。F4 をクリックし、サンプルがロードされたときにマークにセルとしてラベルを付けて、マークを作成します。サンプルを30分間測定します。

信号が安定したら、低グルコース条件に対応する酸素濃度の変化領域を選択します。次に、シリンジを使用して、12.5マイクロリットルの45%滅菌グルコース溶液をチタンローディングポートを介して各チャンバーに加えます。治療を追加するときは、ブドウ糖とラベル付けされたマークを付けます。

信号を安定させ、安定した酸素流束が達成されるまで細胞呼吸を記録します。この時点で、酸素濃度の変化領域を選択して、刺激条件に対応する 16.7 ミリモルのグルコース測定値を表します。信号が安定したら、ローディングポートから各チャンバーに5ミリモルのオリゴマイシンAを1マイクロリットル追加します。

処理が追加されたときに、OligoAとラベル付けされたマークを付けます。信号を安定させ、安定した酸素流束が達成されるまで細胞呼吸を記録します。安定した酸素流束が達成されたら、曲線のこの領域を選択します。

オリゴマイシンAはATP合成酵素を阻害するため、酸素フラックスが発生するのは電子の漏れによるだけで、酸化的リン酸化によるものではありません。次に、最大呼吸数が確立されるまで、1マイクロリットル刻みで1ミリモルのFCCPを追加します。これは、最大の非結合呼吸を表します。

3〜4マイクロリットルのFCCPは、INS-1由来の832/13ベータ細胞の最大の非結合呼吸を誘発するのに十分です。処理を追加するときは、FCCPとラベル付けされたマークを付けます。信号を安定させ、安定した酸素流束が達成されるまで細胞呼吸を記録します。

次に、曲線のこの領域を選択します。FCCPはアンカップリング剤であり、アンカップリング呼吸の測定を可能にします。信号が安定したら、ローディングポートから各チャンバーに5ミリモルのアンチマイシンAを1マイクロリットル追加します。

治療が追加されたときにAntiAとラベル付けされたマークを作成し、曲線選択手順を繰り返します。呼吸計分析プログラムのF3ボタンを押して、アッセイで使用されるミリリットルあたりの細胞数を入力します。単位を細胞/ミリリットルに変更し、細胞濃度を入力して培地をSABに変更します。

バックグラウンドの読み取り値を選択してデータを正規化し、酸素校正フォームを選択して入力します。2.5ミリモルグルコース、16.7ミリモルグルコース、オリゴマイシンA、FCCP、アンチマイシンAから測定値を選択します.レスプロメーター分析プログラム内で、タンパク質濃度を入力し、呼吸測定中の各治療の適切な平均値を選択します。次に、F2をクリックして、クリップボードにコピー機能をクリックします。

これにより、他の分析プログラムで使用するためのデータがエクスポートされます。O2 勾配の負の値を使用して計算します。ビヒクル処理されたコントロールと天然化合物で処理された細胞の 3 〜 5 回の独立した実行のデータをまとめ、INS-1 由来の 832/13 ベータ細胞の無傷の細胞呼吸への影響を判断します。

無傷のINS-1由来の832/13ベータ細胞は、グルコースによって酸素利用の増加が誘発されることを示しています。適切な数のセルを使用することが重要です。この実験で得られた結果は、1ミリリットルあたり100万個の細胞が最適な量であることを示しています。

クルクミンで処理されたINS-1由来の832/13ベータ細胞は、全体的な呼吸に変化を示しませんでした。逆に、単量体のカカオエピカテキンで処理したINS-1由来の832/13ベータ細胞は、2.5ミリモルグルコースおよび16.7ミリモルグルコースで呼吸が増加した。呼吸の増加は、基礎の非リン酸化呼吸状態であるリーク状態、および電子輸送系呼吸または最大呼吸であるETS状態でも観察されます。

このビデオを見た後、インスリン刺激条件下で膵臓ベータ細胞の呼吸機能を直接評価する方法を十分に理解しているはずです。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間で完了します。この手順を試行する際には、低グルコースSABバッファーで細胞を前処理し、アッセイの正確な細胞数を取得することを忘れないでください。

一般に、この方法に不慣れな個人は、効果的な測定のために適切な量の細胞を取得するのに苦労します。細胞が多すぎると、シグナルの評価が難しくなり、セルが少なすぎると、シグナルは一貫して測定するのに十分な高さになりません。この技術の意味は、ミトコンドリア呼吸がインスリン分泌の働きの重要な要素であるため、糖尿病や膵臓ベータ細胞機能の変化によって影響を受けるあらゆる状態の治療または診断にまで及びます。

この手順に続いて、グルコース刺激インスリン分泌などの他の方法を実行して、これらの化合物がインスリン分泌に及ぼす影響など、追加の質問に答えることができますか?この方法はベータ細胞の機能に関する洞察を得ることができますが、筋肉、肝臓、脂肪、その他のミトコンドリア呼吸器分析など、他のシステムにも適用できます。